ИСТИНА

В настоящее время во всём мире наблюдается повышенный интерес к бактериолитическим ферментам, то есть ферментам, катализирующим реакции, приводящие к лизису (растворению) бактериальных клеточных стенок, что в конечном итоге приводит разрушению микробной клетки. В последнее время, в связи с ростом числа резистентных к антибиотикам бактерий, такие ферменты всё чаще рассматривают в качестве альтернативы традиционным антибиотикам. В нашей работе мы использовали лизоцим белка куриных яиц как наиболее изученный с помощью самых разнообразных физических и физико-химических методов «модельный фермент». Лизоцим - бактериолитический фермент класса гидролаз (КФ 3.2.1.17, систематическое название – мукопептид-N-ацилмурамоилгидролаза), катализирующий гидролиз 1,4--связей между остатками N-ацетилмурамовой кислоты и N-ацетилглюкозамина в мукополисахаридах и мукопептидах. Для разработки новых медицинских препаратов на основе бактериолитических ферментов важно уметь правильно определять эффективность действия фермента на живые бактериальные клетки, однако исторически при исследовании этих объектов чаще использовались синтетические субстраты или препараты клеточных стенок. Данные, полученные при каталитическом превращении синтетических субстратов, не дают полноценной оценки действия фермента на живые бактериальные клетки. Использование же в качестве субстрата такого сложного объекта как бактерии требует новых подходов и в методическом экспериментальном плане и в физико-химическом описании каталитического действия фермента. Данная работа приводит теоретическую и экспериментальную базу, благодаря которой, используя турбидиметрический анализ, можно быстро и корректно измерять скорость разрушения бактериальных клеток, пересчитывать турбидиметрические данные изменения оптического поглощения во времени (-dA/dt) в истинные величины изменения концентрации бактериальных клеток во времени (-d[КОЕ]/dt, где КОЕ -Колониеобразующие единицы). Корректность расчётов подтверждается микробиологическим анализом. В данной работе также продемонстрировано, как, используя безразмерные величины скорости изменения степени лизиса (-(1/[КОЕ0])*d[КОЕ]/dt), можно корректно сравнивать данные по эффективности лизиса клеток бактерий разных видов в присутствии различных бактериолитических ферментов или факторов. Отдельной важной темой является получение препаратов иммобилизованного бактериолитического фермента, исследование его действия на бактериальные клетки, возможности его практического применения. Система с иммобилизованным ферментом ещё более усложняется по сравнению с растворимым свободным лизоцимом, появляются новые факторы стерической и диффузионной доступности, методически усложняется экспериментальная процедура измерения кинетики лизиса. Иммобилизация расширяет спектр возможностей практического использования фермента. В случае ковалентной иммобилизации фермента на гемосовместимой полимерной матрице, мы получаем возможность создания композиционного материала для экстракорпоральной очистки крови. Такой материал может использоваться в сорбционных колонках, через которые происходит фильтрация плазмы крови или цельной крови пациента, например, при заражении крови (сепсисе). Для возможности экстракорпорального использования фермента необходимо обеспечить такой вариант ковалентной иммобилизации, который исключит утечку фермента из матрицы и при этом сохранит способность фермента к действию. В работе приведены примеры создания материала на основе лизоцима, ковалентно иммобилизованного нерастворимой полимерной матрице. Исследована кинетика лизиса живых бактериальных клеток в присутствии иммобилизованного лизоцима. Обнаружены различия pH профиля активности иммобилизованного и свободного фермента при действии на живые клетки.