ИСТИНА

В настоящее время одним из ферментов, который представляет большой теоретический и практический интерес, является NAD+-зависимая формиатдегидрогеназа. Формиатдегидрогеназа широко распространена в природе и играет важную роль как в обеспечении энергией метилотрофных микроорганизмов, так и в ответе на стрессовые воздействия в растениях. Формиатдегидрогеназа из бактерии Pseudamonas sp.101 (PseФДГ) является самой термостабильной из всех известных формиатдегидрогеназ и имеет самую высокую каталитическую активность в сравнении с ФДГ из растений и дрожжей. Однако, значение констант Михаэлиса по субстратам у PseФДГ выше, чем в случае формиатдегидрогеназ из растений. Поэтому для улучшения каталитической эффективности PseФДГ необходимо уменьшить значения констант Михаэлиса. Для решения поставленной задачи был использован метод рационального дизайна, который включает в себя введение аминокислотных замен на основе анализа трехмерной структуры рекомбинантного фермента. В случае PseФДГ в результате такого анализа был найден гидрофобный остаток фенилаланина, который находится на поверхности белковой глобулы и участвует в экранировании активного центра фермента от растворителя. Таким образом, замена этого остатка на более гидрофильный может привести к существенному изменению, как каталитических свойств, так и термостабильности. Нами были получены мутантные формы PseФДГ, в которых остаток фенилаланина был заменен на остатки серина, аспарагиновой кислоты и аспарагина. Реакцию мутагенеза проводили с помощью полимеразной цепной реакции. Наличие в гене фермента только заданной мутации было подтверждено сиквенированием. Далее было проведено культивирование рекомбинантных штаммов E.Coli – продуцентов мутантных ферментов. Выделение и очистка мутантных ферментов проводилась по методике, разработанной в нашей лаборатории. Была изучена термостабильность и определены кинетические параметры полученных мутантных форм. Показано, что замена фенилаланина приводит как к изменению термостабильности, так и кинетических параметров.