ИСТИНА

Необходимым условием для нормального протекания процессов эмбриогенеза является слияние клеток. Нарушение слияния может приводить к развитию патологических состояний, таких как различные мышечные дистрофии [1], а также такого заболевание как остеопетроз. Развитие остеопетроза связано с нарушением резорбции вещества кости, в результате чего скелет сильно деформируется, развиваются нарушения кроветворения и параличи. В норме в процессе дифференцировки предшественников макрофагов в остеокласты происходит слияние с образованием многоядерных клеток, в патологии же выявляется блокировка его начальных стадий. Всестороннее изучение слияния макрофагов будет шагом на пути к успешной терапии остеопетроза и других заболеваний [2]. Целью данной работы стало изучить морфологические аспекты слияния макрофагов в остеокласты in vitro на модели мышиной макрофагальной клеточной линии RAW 264.7 с применением различных методов микроскопии: иммунофлуоресцентной, электронной, микроскопии суперразрешения. Данные методы позволяют детально охарактеризовать изменения в строении элементов цитоскелета в процессе слияния макрофагов. В условиях in vitro клетки выращиваются на стекле или пластике, поэтому для создания условий, более приближенных к in vivo, клетки высеивались на стеклянную поверхность, обработанную фибронектином или остеопонтином и BSA в качестве контроля. Микроскопический анализ показал, что на ранних стадиях остеокластогенеза четких различий в организации цитоскелета клеток, растущих на фибронектине и остеопонтине, не обнаружилось. На обоих субстратах в течение 24-48 часов после индукции наблюдается переход от клеток в многочисленными тонкими филоподиями к распластанным клеткам с выраженной ламеллой. В то же время, при росте на BSA начальные стадии характеризуются гораздо меньшей степенью распластывания, а на более продвинутых (48 часов после индукции) клетки образуют достаточно широкие отростки с аккумуляцией f- актина на краю ламеллы. Для временной и пространственной характеристики поэтапного процесса начальных стадий слияния был проведен высокопроизводительный микроскопический скрининг в формате live imaging (метод прижизненной съемки), что дало возможность обнаружить некоторые особенности. Во-первых, после стадии миграции и установления контактов между клетками наступает стадия длительного покоя, во время которой контактирующие клетки остаются малоподвижными в течение длительного (до нескольких часов) времени до момента слияния. Во-вторых, перед слиянием изменяется морфология клеток, количество филоподий уменьшается, происходит распластывание клеток. В-третьих, наиболее часто на ранних стадиях происходит слияние сестринских клеток, недавно закончивших деление. Неожиданным результатом оказался факт способности первичных остеокластов вступать в митоз и успешно его завершать. Таким образом, можно предположить, что эффективность дифференцировки определяется балансом процессов слияния и деления. Новые данные, особенно сведения об обратимости первичного слияния пре-остеокластов, требуют критического анализа существующих представлений о механизмах регуляции слияния соматических клеток. Индукция дифференцировки и слияния макрофагов сопровождается активаций некоторых сигнальных каскадов, одним из центральных участников которых является белок NFATc1 [3]. Было установлено, что кинетика экспрессии NFATc1 зависит от стартовой плотности посадки клеток: при более высокой плотности (5 х 10^5 клеток/мл) пик экспрессии наблюдается через 24 часа после индукции, при более низкой (2.5 х 10^5 клеток/мл) — через 48 часов. С помощью методов молекулярной биологии, а именно - трансфекция клеток миРНК, и методов статистического подсчета был определен вклад белка NFATc1 в образование остеокластов: его блокировка сопровождается значительным снижением процента слившихся клеток по сравнению с контролем. В дальнейшем планируется сконцентрировать усилия на инновационных методах микроскопии суперразрешения SIM и STORM, что даст возможность более детально изучить изменения в строении различных элементов цитоскелета без применения деструктирующих способов фиксации и окраски препаратов для электронной микроскопии.