ИСТИНА

Оксидаза D-аминокислот (DAAO) является ферментом, нашедшим применение в различных областях биотехнологии. DAAO катализирует превращением D-аминокислот в соответствующие α-кетокислоты с образованием пероксида водорода и иона аммония. DAAO используется в медицинской диагностике, в тонком органическом синтезе, однако основным процессом с использованием DAAO является получение 7-аминоцефалоспорановой кислоты (7-АЦК) из цефалоспорина C, а 7-АЦК является основным синтоном при получении цефалоспориновых антибиотиков различных поколений. Наиболее подходящей DAAO для получения 7-АЦК является фермент из дрожжей Trigonopsis variabilis (TvDAAO). TvDAAO обладает наибольшей температурной стабильностью и лучшими каталитическими параметрами в реакции окисления цефалоспорина С среди известных DAAO, однако необходимо дальнейшие улучшение свойств. В случае TvDAAO необходимо улучшать: температурную стабильность для упрощения процесса очистки и возможности использования фермента при повышенных температурах, стабильность против инактивации пероксида водорода, поскольку H2O2 – продукт ферментативной реакции, окисляет TvDAAO. Также для снижения стоимости TvDAAO в общей стоимости процесса необходимо улучшить каталитические свойства фермента. В нашей лаборатории для направленного изменения свойств ферментов мы используем метод рационального дизайна. За время изучения TvDAAO были получено множество мутантных форм TvDAAO с единичными аминокислотными заменами с улучшенными свойствами. В данной работе эти точечные замены были объединены с целью получения многоточечной мутантной TvDAAO перспективной для использования при производстве 7 АЦК. В результате были получены мутантные TvDAAO обладающие в 10–30 раз более высокой температурной стабильностью, в 6–10 раз более высокой стабильностью к действию пероксида водорода и в 3–4 раза более высокими значениями каталитических констант или каталитической эффективности в реакции окисления цефалоспорина С. Работа выполнена при частичной поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант РФФИ 18-34-00594-мол_а)