ИСТИНА

Монооксигеназы Байера-Виллигера являются группой ферментов представляющих большой интерес для биотехнологий, но их применение ограничено низкой стабильностью. Фениалцетонмонооксигеназа (PAMO) из Therbobifida fusca лишена этого недостатка. Фермент обладает высокой стабильностью, состоит из одной FAD-содержащей субъединицы массой 65кДа, использует NADPH в качестве переносчика электронов и проявляет максимальную активность по отношению к небольшими ароматическим кетонам и сульфидам. Кроме того, PAMO способна катализировать процессы в присутствии органических растворителей. Для очистки ферментов методом аффинной хроматографии необходимо получить фермент с последовательностью из 6 или более аминокислотных остатков гистидина (HisTag). Его добавление может влиять на свойства фермента, поэтому в данной работе были получены ферменты с различным его расположением, с целью выбора фермента с наилучшими свойствами. Из-за высокой стоимости NADPH, проведение процессов с PAMO требует использования систем регенерации кофактора. Одним из ферментов, широко используемым для этой цели является формиатдегидрогеназа (FDH). Данный фермент катализирует окисление формиат иона до углекислого газа при сопряженном восстановлении NAD+ до NADH. Так как PAMO использует в качестве кофермента NADPH, в работе использовался полученный ранее в нашей лаборатории фермент из Pseudomonas sp.101 с измененной коферментной специфичностью с NAD+ на NADP+. Кроме того, для повышения эффективности систем регенерации существует подход создания систем химерных белков. Целью данной работы было получение генов фенилацетонмонооксигеназ с различным расположением His-Tag и двух систем гибридных белков на основе FDH и PAMO, с использованием различных формиатдегидрогеназ. Была проведена оптимизация условий экспрессии полученных генов и очистки выделенных ферментов. Для свободных PAMO с His-Tag была изучена каталитическая эффективность ферментов в процессе окисления бензилацетона. В случае полученных систем FDH-PAMO были изучены каталитические характеристики фенилацетонмонооксигеназной и формиатдегидрогеназной реакций. Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и Правительства Москвы в рамках научного проекта № 19-34-70036.