ИСТИНА

Актуальность исследования. Исследование направлено на решение фундаментальной научной проблемы, касающейся регуляции беспозвоночными животными жизнедеятельности микроорганизмов в почвах, а именно выявление особенностей влияния почвенных беспозвоночных животных (на примере дождевых червей - наиболее важных почвенных представителях мезофауны) на почвенные микроорганизмы (бактерии) при воздействии на них пищеварительной среды животных. Взаимодействия беспозвоночных животных и микроорганизмов в значительной степени определяют почвенные процессы: разложение и трансформацию растительных остатков, образование гумусовых веществ, формирование пула элементов питания растений [1]. Предполагается, что бактерии (наряду с грибами) являются одними из основных источников пищи для дождевых червей. Питаясь, последние регулируют рост микроорганизмов, выедая одни и создавая благоприятные условия для роста других микробных популяций. При пассаже меняются состав, обилие и что особенно важно физиологическое состояние (активность) бактерий. Каков биохимический механизм воздействия пищеварительной среды на бактериальные популяции пока не известно. Таким образом, выяснение особенностей воздействия пищеварительной среды беспозвоночных на физиологическое состояние микроорганизмов позволит объяснить огромное разнообразие наблюдаемых эффектов от взаимодействия этих групп почвенных организмов: отбор и размножение одних почвенных микробных популяций при питании и элиминирование других, наличие симбиотических микроорганизмов в пищеварительном тракте, выявить возможные механизмы действия пищеварительной среды животных на микробные клетки. Практическая значимость. Помимо сугубо научных целей исследование преследует прикладные задачи: предсказывать последствия нарушения связей между беспозвоночными и микроорганизмами в антропогенно нарушенных почвах разных природных зон, а так же создания вермикомпостов (биогумус) с целенаправленно заданными свойствами. Вермикомпост - это универсальное органическое удобрение, получаемое при переработке органических отходов компостными дождевыми червями. Целью было исследование воздействие пассажа через кишечник дождевых червей на физиологическое состояние бактериального сообщества. Объекты исследования промышленные вермикомпосты, произведенные по технологии «движущейся гряды» из навоза крупного рогатого скота (КРС) на вермиферме ООО «Ростагроэкология» (п. Пирогово, Московская обл.) и ООО «Флора-JI» (Липецкая обл.). В лабораторном эксперименте сравнивались бактериальные сообщества почв (выщелоченный чернозём, агроторфяная и дерново-подзолистая почвы) и компосты со свежими копролитами Eseniafetida andrei (компосты), Aporrectodea caliginosa (почвы). Основным методом исследования в работе является разрабатываемый нами новый кинетический метод определения физиологического состояния бактерий в почве (in situ). Метод заключается в исследовании кинетики роста самопроизвольных смешанных периодических культур бактерий, возникающих после инокуляции почвенной суспензией жидких питательных сред. В состав питательных в качестве единственного источника органического вещества выбраны распространённые биполимеры животного и растительного происхождения (пектин, крахмал, целлюлоза, ксилан, казеин, хитин), мономеры (глюкоза, ксилоза), распространённый продукт брожения (ацетат), ароматические соединения (коричная кислота и фенилаланин) и ряд других сред. Для проведения анализа была сконструирована опытная научная установка, включающая в себя климатическую камеру, позволяющую стандартизировать температуру и влажность в которую помещался иммуноферментный анализатор «Sunrise», фирмы Тесап, осуществляющий автоматически динамические измерения роста бактерий по оптической плотности суспензии в ячейках находящейся внутри анализатора 96-луночной культуральной планшеты в которую и были внесены питательные среды. Кривые микробного роста описываются и интерпретируются в рамках синтетической хемостатной модели (СХМ) микробного роста [2]. Разрабатываемый нами метод отличает от других возможность одновременного определения функционального (трофического) разнообразия (число сред, на которых регистрируется рост); физиологического состояния бактерий г о (по длительности лаг-фазы и характеру выхода из неё) и кинетического параметра роста - максимальной удельной скорости роста (jumax), отражающий экологическую стратегию роста бактерий. Метод отчасти заменяет «накопительную культуру», так как позволяет накопить и выделить на агаризованную среду различных бактерий. Статистическая обработка данных. Все исследования проводили как минимум в 4- х повторностях эксперимента и подвергались проверке на статистическую значимость. Результаты и их обсуждение. Установлено, что пассаж субстрата через кишечник приводит к существенным перегруппировкам в составе бактериального сообщества свежих копролитов двух видов червей для всех исследуемых почв, компостируемых смесей (Рис. 1а). Этот факт подтверждает культурально - морфологический анализ колоний бактерий на чашки Петри, высеянных из жидких питательных сред. Не удалось зафиксировать ни снижение, ни увеличения числа потребляемых субстратов в копролитах, что свидетельствует об отсутствии сильных изменений в функциональном (трофическом) разнообразии исследуемого бактериального блока. Для дальнейшей интерпретации результатов, необходим теоретический анализ кривых роста с привлечением СХМ (Рис. 16). Глюкоза Рис. 1. (а) Пример кривых роста, видна разница между бактериальными сообществами, выделенными из агроторфяной почвы и свежих копролитов Aporrectodea caliginosa; (б) Начального участка роста бактерий, по которому расчитывают го и цтах. 161 Математический анализ кривых роста, полученных для бактериальных сообществ вермикомпостируемого навоза КРС и копролитов Esenia fetida andrei, а также почв и копролитов Aporrectodea caliginosa показал наибольшие различия по параметру характеризующему физиологическое состояние бактерий и связанного с длительностью лаг-фазы. Параметр изменяется с 0 до 1 и чем он выше, тем метаболически более готовы бактерии расти на том или ином соединение или условиях среды. В целом, знак и величина эффекта сильно разнилась в зависимости от типа почв и состава питательной среды, однако можно выявить общие тенденции, связанные с особенностью пищеварительного тракта червей: анаэробными условиями, поступление азота от червя. В частности в копролитах наблюдалось снижение метаболической готовности потребления ряда растительных полимеров крахмал, пектин, ксилан, что возможно связано с анаэробными условиями в кишечнике червя. Эта же причина стоит видимо за метаболической активизацией потребления ацетата - одного из основных продуктов брожения. Так же увеличивается лаг-фаза при росте на среде без азота, что видимо связано с тем, что микроорганизмы привыкли получать минеральный азот от дождевого червя. Отмеченные особенности были получены для копролит полученных при 12 часовом пребывании дождевых червей в чашках Петри при температуре +5°С. В старых копролитах ситуации может быть совсем иной. Не ограничиваясь модельными экспериментами, мы изучали влияние червей Esenia fetida andrei на метаболическую готовность потреблять крахмал, целлюлозу и казеин в ходе промышленного вермикомпостирования навоза КРС на вермиферме ООО «Ростагроэкология». Анализ свежеотобранных образцов выявил всплеск активности через две недели, после внесения червей, который был очень сильный и длительной в отношении крахмала и не столь сильный и кратковременной в отношении целлюлозы и казеина (Рис. 2). Этот факт с одной стороны объясняет почему происходит сокращение времени созревания вермикомпоста в присутствии дождевых червей, а с другой позволяет предложить параметр грдля определения времени созревания вермикомпоста. Крахмал Карбоксиметилцелпюлоза Кззеин корм две ведет* трк >.'есяцз корм две недели три уесяцэ готовый две недели* три месяца готовый Рис. 2. Изменение физиологического состояния бактерий го, (медиана-точки, квартили- усы) растущих на крахмале, карбоксиметилцеллюлозе и казеине в процессе созревания вермикомпоста. 162 Выводы: 1.Кинетический метод определения физиологического состояния бактерий в природе может быть использован для оценки микробиологического качества и зрелости вермикомпоста 2. Вермикомпосты ООО «Ростагроэкология» и «Флора-Jl» отличаются хорошим микробиологическим качествами: высоким функциональным разнообразием, относительно высокой активностью бактериального блока 3. Физиологическое состояние бактериального сообщества свежих копролитов несёт на себе отпечаток условий кишечника дождевых червей Благодарности: за обсуждение результатов в.н.с. каф. биологии почв факультета почвоведения МГУ, д.б.н. Б.А. Вызову, за любезно предоставленные вермикомпосты А.Б. Абдуразакову и Б.С. Курбатову. Работа выполнена в рамках темы кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ имени М.В. Ломоносова «Биоразнообразие и ценотические связи почвенных микроорганизмов в наземных экосистемах» и при финансовой поддержке гранта Президента Российской Федерации (грант МК-5552.2011.4) и гранта РФФИ № 11-04- 00580-а. 1. Вызов Б.А. Зоомикробные взаимодействия в почве. М.: Изд-во ГЕОС, 2005, 213 с. 2. Паников Н.С. Кинетика роста микроорганизмов. М.: Из-во «Наука», 1991. 311 с. 163