ИСТИНА

Сайт-специфические эндонуклеазы рестрикции представляют собой прекрасную модельную систему для изучения аспектов специфического ДНК-белкового взаимодействия. Сайт-специфическая ДНК-никаза N.BspD6I представляет собой одну из субъединиц гетеродимерной сайт-специфической эндонуклеазы рестрикции R.BspD6I [1]. Она несет функцию узнавания специфического сайта двухцепочечной ДНК и расщепления одной из ее цепей на расстоянии 4 п.о. в стороне от сайта узнавания [2]. Структура никазы N.BspD6I была определена нами ранее методом рентгеноструктурного анализа [3]. Настоящая работа посвящена изучению олигомерного состояния растворенной никазы при высокой концентрации, и ее способности в этих условиях связывать ДНК-дуплекс. Работа выполнена в рамках проекта по кристаллизации комплекса с ДНК сайт-специфической никазы N.BspD6I. В работе использовались методы нативного электрофореза в ПАА-геле, гель-фильтрационной хроматографии на колонке Superdex200 10/300 и методом динамического светорассеяния (DLS). В ходе работы оптимизирована методика индукции клеток штамма-продуцента, а также модифицирована техника выделения белка. При выделении использовалась аффинная хроматография на гепарин-сефарозе и Ni-NTA-агарозе, в результате чего был получена никаза N.BspD6I c чистотой 95% и выше. Выход составил ~4 мг/л культуры. Установлено, что в растворе при концентрации от 0.04 мг/мл никаза N.BspD6I образует димеры, тримеры и более высокомолекулярные конгломераты, причем молекулярный вес конгломератов прямо пропорционален концентрации никазы в растворе. Присутствие специфического дуплекса разбивает эти конгломераты – образуется комплекс мономерной никазы и дуплекса. Для образования гомогенного комплекса достаточно превышения концентрации дуплекса над концентрацией никазы в 1,3 раза в молярном соотношении при концентрации никазы 1,5 мг/мл. Исследовано влияние 2-валентных ионов (Ca2+, Mg2+, Mn2+) на поведение белка в присутствии дуплекса. Показано, что в присутствии ионов Ca2+ образуется пререакционный комплекс никазы и ДНК, тогда как в присутствии ионов Mg2+ образуется постеакционный комплекс; после внесения разрыва в цепь ДНК никаза остается связанной с дуплексом, а не покидает его, как это показано для сайт-специфических эндонуклеаз рестрикции типа IIP. Получены комплексы никазы с дуплексами 18 п.о. и 21 п.о. длиной. Комплексы сконцентрированы до концентрации 14 и 20 мг/мл соответственно и использованы для получения кристаллов методом сидячей капли. Литература 1. Юнусова А.К., Рогулин Е.А., Артюх Р.И., Железная Л.А., Матвиенко И.Н. (2006) Никаза N.Вsp6I – большая субъединица гетеродимерной эндонуклеазы рестрикции R.BspD6I // Биохимия, т. 71, № 7. 1002-1008. 15 Ломоносов–2008 16 2. Железная Л.А., Перевязова Т.А., Альжанова Д.В., Матвиенко Н.И. (2001) Сайт-специфическая никаза из штамма Bacillus species D6 // Биохимия, т. 66, №9, с. 1215-1220. 3. Kachalova G.S., Rogulin E.A., Artyukh R.I., Perevyazova T.A., Zheleznaya L.A., Matvienko N.I. and Bartunik H.D. (2005) Crystallization and preliminary crystallographic analysis of the site-specific DNA nickase Nb.BspD6I. Acta Crystallographica F61, p. 332-334.