ИСТИНА

Рибосомный белок S1, обладающий сложной доменной структурой, является крупнейшим полифункциональным белком рибосомы у бактерий. В зависимости от вида микроорганизмов в состав белка входят от 1 до 6 повторяющихся доменов или S1-мотивов. Выделенный нами из Thermus thermophilus S1 белок до сих пор не был закристаллизован, в связи с высокой динамичностью пяти его доменов в растворе. Ранее было показано, что в зависимости от ионной силы раствора белок обладает различной склонностью к формированию ассоциатов, и было предложено, что за агрегацию ответственны именно S1-мотивы. Для определения склонных к агрегации участков аминокислотной последовательности белков нами были использованы биоинформатические инструменты предсказания амилоидогенных аминокислотных остатков в белках S1 (60 кДа) и S1 (49 кДа) из Thermus Thermophilus. С помощью онлайн-программ FoldAmyloid, ArchCandy, PASTA 2.0, Waltz и AGGRESCAN были рассчитаны амилоидогенные участки, большинство из которых были локализованы в белковых доменах. Теоретические данные были сопоставлены с экспериментальными результатами ограниченного протеолиза агрегатов и последующим ВЭЖХ-МС анализом полученных гидролизатов белков. Ограниченный протеолиз позволяет получать информацию об участках белковой цепи, защищенной от действия протеаз и таким образом выявлять фрагменты белка, входящие в остов агрегатов. Для оценки защищенности участков амилоидных структур от протеаз мы использовали смесь из протеазы неспецифического действия (протеиназу К) и двух специфических протеаз (трипсин и химотрипсин). Хроматографическое разделение пептидов , входящих в амилоидный остов проводили на мультиколонке Acclaim PepMap RSLC (Thermo Scientific, USA). В качестве детектора ионов использовали масс-спектрометр Orbitrap Elite (Thermo Scientific, Germany). Анализ полученных данных проводили с помощью программы PEAKS Studio 7.5. В результате исследований были определены пептиды, защищенные от воздействия протеаз, для белков S1 (60 кДа) и S1 (49 кДа). Анализ распределения пептидов по доменам позволил выявить наиболее склонные к агрегации участки молекул обоих белков. Данные анализа свидетельствуют, что фрагмент S1 (49 кДа) в меньшей степени склонен формировать агрегаты в сравнении с целым белком. Полученные результаты ВЭЖХ-МС анализа амилоидогенности белковых участков хорошо согласуются с данными программ (FoldAmyloid, ArchCandy, PASTA 2.0, Waltz и AGGRESCAN) и могут быть использованы для разработки третичной структуры и дизайна пептидов или белков на основе последовательности S1, а также молекулярно-филогенетической классификации микроорганизмов. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ (проект №18-1400321) и при участии Центра Коллективного пользования «Структурно-функциональные исследования белков и РНК» ИБ РАН (584307).