ИСТИНА

Классификация микробных сообществ остаётся актуальной задачей почвенной микробиологии вообще, а не только изучения зоомикробных взаимодействий в почве. Классификация систематизирует общие и индивидуальные черты микробных сообществ и выявляет их связи со свойствами почв. Это важно для биоиндикации. Задача классификации решается 1. при метагеномном исследовании почв и кишечных сообществ, 2. при исследовании функционирования микробных комплексов в кишечнике беспозвоночных животных, например при анализе спектра ферментативной активности почв. Так же эту задачу решает направление, которому посвящена работа - это экофизиологическая характеристика сообществ, например по спектру потребления субстрата. Исследование экофизиологических особенностей конкретных микроорганизмов занимаются давно и широко во всём мире. По существу эти исследования представляют собой аутэкологическую характеристику изучаемых 151 микроорганизмов. Как правило, проводится исследование in vitro (в лабораторных условиях) в градиенте силы влияния абиотических (поллютанты, температура и т.д.) и биотических (антибиотики, токсины, биологические жидкости и т.д.) на те или иные кинетические (ростовые) характеристики микроорганизмов. Исходя из найденной зависимости «доза-эффект» определяется оптимум и пессимумы изучаемых биометрических параметров микроорганизмов (максимальная удельная скорость роста, урожайность микроорганизмов на среде, радиальная скорость роста колоний и т.д.). Термин «экофизиология сообщества микроорганизмов» напротив не распространён в научном мире и не имеет чётко определения. Под экофизиологической характеристикой микробного сообщества мы понимаем определение: его физиологического разнообразия, физиологического состояния его членов, преобладающей среди членов микробного сообщества экологической стратегии, установление состава физиологических групп микроорганизмов. Цель работы - дать экофизиологическую характеристику кишечных сообществ по ряду кинетических параметров и установить возможности методов математической обработки данных: метода главных компонент, дискриминантного анализа, дисперсионного анализа для классификации микробных сообществ только по одному из экофизиологических параметров: Y - урожайность ассоциаций микроорганизмов на питательных средах. Эти параметры в работе определяется комплексным структурно-функциональным методом устанавливающим кинетические параметры жидких смешанных культур, формирующихся после инокуляции почвенной суспензией набора селективных сред. Наша рабочая гипотеза - полученные в лаборатории данные по росту этих ассоциаций отражают экофизиологические особенности микробных сообществ непосредственно в природе. Микробиологическим объектом исследования был выбран один из важнейших для почв грибной и бактериальный гидролитический блоки. Поэтому в качестве селективных были выбраны среды с антигрибными (нистатин, цилогексемид) или антибактериальными (хлорамфеникол) антибиотиками, содержащие в качестве единственного источника углерода полисахариды: крахмал, пектин, целлюлозу, хитин, инулин, агарозу, ксилан, декстран; аналог жиров: твин 20; нуклеиновую кислоту; белки: казеин, кератин. Рост ассоциаций на полимерах принимался аналогичным росту чистой культуры и описывался новой авторской математической «комплексной моделью периодической культуры», разработанной для чистой культуры микроорганизмов. Развитие ассоциаций характеризовалось параметрами этой модели. Величины кинетических параметров ассоциаций полагаются пропорциональными значениям кинетических параметров членов микробного сообщества непосредственно в почве. Модель оперирует параметром среды 50 - начальной концентрацией ростового субстрата s (г/л) и параметрами культуры: х0 - начальное значение концентрации культуры х в питательной среде; tnar - значение времени t когда кончается лаг-период в развитии культуры ч; ц т - максимальное значение удельной скорости роста (х, ч 1; ро -начальное значение переменной физиологического состояния растущей культуры р; у = 100+1п(/)о) - метаболическая готовность культуры к росту на питательной среде; константа полунасыщения (г/л) Кр = s при р = 0.5рт, где рт = 1 - максимальное значение р; Y - экономический коэффициент роста микроорганизмов на пищевом субстрате, Y = (xm-x0)/s0, где хт максимальная концентрация культуры; ат — максимальная удельная скорость отмирания, ч '; тотм - время начала экспоненциального отмирания, ч; rj0 - значение переменной физиологического состояния rj отмирающей культуры в момент начала экспоненциального отмирания. При t< То™ dx s ds их dp , s — = рх,ц = цтР—-- = = цпр{- p) at K+s s dt Y dt К p +5 При t> To™ dx da drt - = -аХ-,тГ-атт- = -атП<\-1) Экологическую стратегию ассоциаций мы количественно определяем по величинам параметров цт, Кр, цт/Кр, Y, ат, rj0., характеризующие разные участки кривой роста и отмирания периодической смешанной культуры. В данной работе мы сконцентрировали внимание на параметр Y. Микробиологическими объектами исследования выступали грибные и бактериальные аэробные, факультативно - анаэробные сапротрофные комплексы, культивируемые на традиционных питательных средах. Непосредственным объектом исследования были корм, содержимое кишечника (транзитное кишечное сообщество) и свежие (суточные) экскременты сапротрофных двупарноногих многожек Cylindroiulus caeroleocinctus (Москва), Pachyiulus flavipes (Симеиз, Крым) Orthomorpha sp.l, Thyropygus sp. 1 , неописанный вид отряда Spirobolida (национальный парк Вьетнам). Изучались так же корм (почва или компост в которой содержались животные) и копролиты различных экологических групп дождевых червей Aporrectodea caliginosa (эндогейный), Eisenia foetida andrei (эпигейные) и Lumbricus terrestris (эпи-эндогейные). Так же исследовались экскременты личинок комаров-толстоножек (сем. Bibionidae, род Bibio sp.) и их корма - опада широколиственных пород деревьев. В качестве дополнительных объектов 153 сравнения использовались данные, полученные при анализе микробных сообществ различных почв. Анализ данных методом главных компонент показал (рис.1), что по Y (урожайность бактериальных ассоциаций на средах) микробные сообщества разделяются только по 2-м достоверным закономерностям, объясняющим суммарно 40-60% дисперсии. 1-ая: чем больше главная компонента 1, тем ниже среднее арифметическое значение Y (г=-0,95) - показатель функционального биоразнообразия микробных сообществ. При этом кишечное сообщество многоножек занимает крайнее левое положение, что указывает на наибольшее функциональное разнообразие гидролитического блока именно в кишечнике по сравнению с другими почвенными сообществами. 2-ая: чем больше главная компонента 2, тем больший стресс испытывает МС (в первую очередь - дефицит влаги). В целом, однофакторный дисперсионный анализ показал, что Y на всех средах реагирует на фактор (принадлежность микробных сообществ к определённой почве) значимо (р<0,05) и сильно (частная rj2 >0,5). Дискриминантный анализ параметра Y на 12 средах характеризующих 200 МС, из 60 классов позволяет подтвердить априорную классификацию со 100% точность около 70% МС Физиологическое разнообразие (доля от суммарного потребления полимеров) гидролитического комплекса бактерий для корма и копролитов дождевых червей не изменяется, а для кивсяков снижается в экскрементах. Физиологическое разнообразие гидролитического грибного комплекса в следствии пассажа через кишечник диплопод снижается. Максимальная концентрация бактерий увеличивается на выбранных селективных средах после пассажа. Предположительно вызвано увеличением доли г- стратегов в ряду сообществ корм-кишечник-экскременты. Эко-физиологические параметры экскрементов, корма и кишечников существенно различаются согласно дискриминантному анализу и методу главных компонент. Для дискриминации наиболее значимы жиры (твин 20), белки (казеин), углеводы (целлюлоза и ксилан). Увеличение доли быстрорастущих и доли физиологически активных бактерий для Orthomorpha от опада к кишечнику и снижение к экскрементам. В целом при пассаже метаболическая готовность грибов к росту снижается, но при этом скорость подготовки к росту увеличивается. Специфических экофизиологических отличий грибных сообществ из экскрементов и кишечника диплопод разных родов и природных зон не выявлено. Однако в целом сообщества из кишечника, экскрементов и корма различаются по виду кривой роста на средах с целлюлозой, ксиланом, инулином, кератином казеином. Реакция грибного сообщества на пассаж через кишечник диплопод зависит от физиологического состояния грибов в корме, чем более разложенная подстилка, тем эффект меньше. У сапротрофных личинок комаров-толстоножек наблюдается более существенное увеличение доли бактерий r-стратегов, чем у детритотрофных эндогейных дождевых червей даже при условии питания последних опадом. Что косвенно указывает на более интенсивное разложение органического вещества у комаров-толстоножек.