ИСТИНА

Тест-системы на основе живых прокариотических и эукариотических клеток весьма чувствительны к внешним воздействиям, что позволяет их применять для оценки токсических эффектов химических веществ, скрининга лекарственных средств, изучения функционирования организмов в условиях клеточного стресса различной природы. Высокочувствительные биолюминесцентные методы детекции могут использоваться в режиме реального времени без разрушения клеток. Достоинством биолюминесцентных методов является отсутствие фонового сигнала и простота детекции - они не требуют источника возбуждающего излучения. Особый интерес представляет биолюминесцентная система светляков, в основе которой лежит катализируемая люциферазой реакция окисления D-люциферина кислородом воздуха в присутствии АТФ и ионов магния, в ходе которой наблюдается стабильное во времени свечение. Клетки, продуцирующие люциферазу светляков (так называемые биолюминесцентные клетки), содержат два биолюминесцентных маркера: АТР и люциферазу и перспективны при изучении эффекта различных физиологически активных агентов на живые системы. В данной работе разработана тест-система на основе рекомбинантных клеток E.coli BL-21 (DE3) Сodon Plus, экспрессирующих термостабильную (TS) люциферазу Luciola mingrelica, что позволяет проводить исследования при повышенных температурах. Показана эффективность использования тест-системы для изучения механизма действия мембрано-активных соединений на живые клетки по изменению содержания АТФ и люциферазы внутри и вне клеток на примере действия катионного полипептидного антибиотика полимиксина Е (колистина). Накопление внеклеточной люциферазы однозначно свидетельствует о протекании необратимого разрушения клеток при повреждении мембраны. Уровень внеклеточного АТРex также является информативным индикатором изменения проницаемости клеточной мембраны как в ходе роста клеток, так и под действием литического агента, вызывающего вытекание внутриклеточного АТРin во внеклеточное пространство. Обнаружено, что более сильный бактерицидный эффект колистин оказывает на растущие, метаболически активные клетки, в то время как клетки, лишенные питания, оказываются более устойчивыми к действию антибиотика. В отсутствие колистина АТРex составляет ~7 % от АТРin, концентрация Lucex также мала, что свидетельствует о целостности клеточной мембраны. При инкубации клеток в питательной среде с колистином АТРex возрастает всего до 20-30% от исходной величины АТРin. Скорость снижения уровня АТРin в три раза выше, чем скорость накопления АТРex и падение ATPin происходит не за счет высвобождения ATP через образующиеся поры во внеклеточное пространство, а за счет утилизации внутри клетки и остановки его синтеза. По-видимому, колистин проникает в периплазматическое пространство микробной клетки и разрушает систему синтеза АТР. Отмечено, что ATPin вне клеток сохраняется в суспензии и после полной гибели клетки. Следовательно, во внеклеточном пространстве отсутствуют ферменты, гидролизующие ATP. Клетки линии НЕК293, транзиентно трансфицированные плазмидой pсDNALuc, экспрессирующей люциферазу светляков, были использованы для изучения кинетики взаимодействия мембраны клеток с дигитонином (монодесмоидный сапонин) и его аналогов по высвобождению внутриклеточных компонентов - АТФ и люциферазы, в реакционную среду в режиме реального времени. Под действием дигитонина, образующего комплексы с холестерином клеточной мембраны, приводит к дезинтеграции ее структуры и образованию пор. Показано, что дигитонин наиболее токсичен для клеток при концентрации 0,08 мМ и выше, когда в течение нескольких десятков секунд достигается максимальная концентрация высвобождаемых компонентов, а на кинетических кривых исчезает период индукции. Диосцин - аналог дигитонина, взятый в той же концентрации, начинает действовать значительно позже, и биолюминесцентный сигнал появляется через 30 мин. Уменьшение числа углеводных циклов в молекуле сапонина привело к снижению его литической активности. Наличие объемного заместителя в агликоновой части молекулы протодиосцина препятствует связыванию стероидальной составляющей с мембраной и он не оказывает действия на клетки HEK293. Таким образом, разработанная биолюминесцентная тест-система на основе живых клеток с использованием низкомолекулярного маркера АТФ и высокомолекулярной люциферазы, позволяет в режиме реального времени изучать in situ процессы изменения проницаемости клеточных мембран на ранних стадиях процесса лизиса клеток под действием литических агентов. Работа выполнена в рамках госрегистрационной темы МГУ имени М.В. Ломоносова АААА-А21-121011290089-4.