ИСТИНА

Оксидаза D-аминокислот (DAAO, КФ 1.4.3.3) катализирует реакцию образования α кетокислот с выделением пероксида водорода и иона аммония, используя в качестве субстратов соответствующие D-аминокислоты и молекулярный кислород. Данный фермент находит широкое практическое применение. Наиболее важным является крупнотоннажный процесс получения 7-аминоцефалоспорановой кислоты, из которой затем получают цефалоспориновые антибиотики различных поколений. Для эффективного практического применения необходимо проводить оптимизацию свойств природного фермента под цели и задачи конкретного биотехнологического процесса, что в свою очередь невозможно без детального понимания взаимосвязи структуры и функции фермента. В нашей лаборатории был проведен анализ структуры DAAO из дрожжей Trigonopsis variabilis и определен кислородный канал этого фермента с помощью метода Implicit ligand sampling. Данный метод позволяет установить центры связывания кислорода и пути его миграции внутрь глобулы. Одним из остатков, находящихся вблизи такого центра и в непосредственной близости к FAD, является метионин-245. По результатам выравнивания в DAAO из дрожжей Rhotodorula gracilis данному остатку соответствует остаток Ile225, который также участвует в образовании центра связывания кислорода. Известно [1], что замена такого остатка привела к значительному улучшению каталитических свойств фермента по кислороду, поэтому нами было решено сделать замены остатка Met245 с целью изучения роли этого остатка в каталитической функции фермента. Для данной работы методом направленного мутагенеза получены гены мутантных форм DAAO с подобранными заменами. Направленный мутагенез выполнен при помощи полимеразной цепной реакции. Проведена экспрессия полученных генов в клетках E. coli, очистка ферментов с использованием анионообменной хроматографии и гель-фильтрации. Изучены свойства данных ферментов: субстратная специфичность и стабильность к действию повышенных температур. Литература 1. E. Rosini et al. Modulation of O2 reactivity in D-amino acid oxidase // FEBS Journal 278 (2011) 482–492