ИСТИНА

Оксидаза D-аминокислот (DAAO) – флавинсодержащий фермент, катализирующий окислительное дезаминирование D-аминокислот в соответствующие α кетокислоты с образованием иона аммония и восстановлением молекулярного кислорода до пероксида водорода [1]. Оксидаза D-аминокислот находит широкое применение на практике, включая синтез α кетокислот, получение неприродных L аминокислот, детекцию D-аминокислот в биологических образцах. Но наиболее важным является процесс получения 7 аминоцефалоспорановой кислоты (7-АЦК) из цефалоспорина С, которая является исходным соединением для получения полусинтетических β-лактамных антибиотиков нового поколения. Наиболее подходящим для этих целей считается DAAO из дрожжей Trigonopsis variabilis (TvDAAO), так как он обладает высокой каталитической активностью по отношению к цефалоспорину С. Во время синтеза 7-АЦК используют иммобилизованную форму TvDAAO. Иммобилизация позволяет увеличить стабильность фермента в условиях производственного процесса и делает возможным повторное использование белка. Большие затраты на получение фермента и высокая стоимость используемых носителей являются движущей силой для усовершенствования процесса иммобилизации. Целью нашего исследования была оптимизация условий иммобилизации TvDAAO RDSFLN [2] для использования в процессе окисления цефалоспорина С на серии полиметакрилатных носителей с различными функциональными группами Sepabeads® EC, которые, в отличие от многих других носителей, известны своей высокой механической прочностью и устойчивостью к слипанию в воде. В ходе данной работы нами была предложена методика обратимой иммобилизации TvDAAO RDSFLN на ионообменном носителе Sepabeads® EC-QA в 50 мМ Tris-HCl pH 9.0 c выходом иммобилизации более 90%. Определены кинетические свойства иммобилизованной формы TvDAAO в реакции окисления цефалоспорина C. Также определены температурная стабильность и стабильность к действию пероксида водорода. Литература 1. Tishkov V.I., Khoronenkova S.V. D-Amino acid oxidase: structure, catalytic mechanism, and practical application // Biochemistry (Moscow). 2005. № 70(1). С. 40-54. 2. Atroshenko D.L., Shelomov M.D., Zarubina S.A., Golubev I.V., Savin S.S., Tishkov V.I. Multipoint TvDAAO mutants for cephalosporin C bioconversion // International Journal of Molecular Sciences. 2019. № 20. С. 4412-4412.