ИСТИНА

Оксидаза D-аминокислот (DAAO, КФ 1.4.3.3) катализирует реакцию образования α-кетокислот с выделением пероксида водорода и иона аммония, используя в качестве субстратов соответствующие D-аминокислоты и молекулярный кислород. Данный фермент находит широкое практическое применение. Наиболее важным является крупнотоннажный процесс получения 7-аминоцефалоспорановой кислоты, из которой затем получают цефалоспориновые антибиотики различных поколений. Поэтому поиск и выделение новых оксидаз D-аминокислот является важной промышленной задачей. В качестве объекта исследования в данной работе была изучена оксидаза D-аминокислот из дрожжей Ogataea parapolymorpha DL-1, кодируемая последовательностью RefSeq XM_014079341. Соответствующие белковые последовательности -- RefSeq XP_013934816 или UniProt HPODL_00899. Соответствующий фермент был нами обозначен как OpaDAAO-5. В данной работе была проведена экспрессия OpaDAAO-5 в клетках E.coli BL21 с последующей очисткой при помощи двукратной анионообменной хроматографии на колонке MonoQ. Чистота препарата OpaDAAO-5 составляла более 90% по результатам SDS-PAGE. В результате изучения зависимостей активности и стабильности от pH были подобраны буферные системы для изучения кинетических свойств и для хранения фермента. В результате изучения профиля субстратный специфичности оказалось, что для OpaDAAO-5 наилучшими субстратами являются гидрофобные аминокислоты. Построение модельной структуры данного фермента в программе SwissModel и последующий анализ модельного активного центра подтверждают полученный профиль субстратной специфичности. Также была подробна изучена кинетика термоинактивации OpaDAAO-5 при различных температурах, концентрации фермента и наличии экзогенного FAD. OpaDAAO-5 проявляет более высокую температурную стабильность по сравнению с ранее изучаемой нами DAAO из дрожжей Trigonopsis variabilis и сравнимую с наиболее стабильными DAAO, описанными в литературе.