ИСТИНА

Белок ядерного экспорта NEP вируса гриппа А участвует в одном из важнейших про- цессов жизненного цикла вируса - экспорте вирусного генома из ядра в цитоплазму. Ранее нами было показано, что рекомбинантный белок склонен к образованию агрегатов. Це- лью настоящей работы было изучение этого явления методом химического кросслинкинга - подхода, широко используемого для исследования структуры белковых комплексов. Препараты NEP, содержащие на N- или С-конце His(6)-модуль (NEP-N и NEP-C), полу- чали в результате продукции белков в специально созданной бактериальной экспрессион- ной системе с последующей аффинной хроматографией на Ni-NTA-агарозе. Для изучения агрегации проводили эксперименты по «сшивке» (кросслинкингу) присутствующих в рас- творе белковых агрегатов глутаровым альдегидом - бифункциональным реагентом, взаи- модействующим с ����-аминогруппами остатков лизина. При проведении реакции варьирова- ли следующие параметры: концентрацию глутарового альдегида (0,001 М - 0,2 М), рН рас- твора, время инкубации (8-30 мин), присутствие низкомолекулярных добавок (соли арги- нина, SDS и другие). Продукты реакции анализировали методом электрофореза в 10-15% SDS-ПААГ. Полученные данные свидетельствуют о наличии в растворе димерных и более высокомолекулярных продуктов сшивки (составляющих до 70% от массы всего белка), что подтверждает высокую склонность белка к агрегации. В присутствии 100 мМ аргинина (дезагрегирующий агент) доля олигомеров существенно уменьшается, а добавление 1% SDS полностью предотвращает образование агрегатов. Ранее в работе [1] с использова- нием другого бифункционального реагента этиленгликоль-бис(сукцинимидилсукцината) [EGS] было показано, что только делеционный вариант белка NEP, лишенный N-концево- го домена (но не полноразмерный белок), способен к образованию димера. Таким образом, в настоящей работе впервые методом кросслинкинга с использованием глутарового альдегида было продемонстрировано наличие высокомолекулярных агрегатов растворах белка NEP при физиологических условиях. Pабота выполнена пpи финанcовой поддержке Pоccийcкого фонда фундаментальныx иccледований (гpанты №№ 15-32-20629 и 13-04-01504). Источники и литература 1) Akarsu H., Burmeister W.P., Petosa C. Crystal structure of the M1 protein-binding domain of the influenza A virus nuclear export protein (NEP/NS2). // EMBO J. 2003. N. 22(18). P. 4646–4655.