ИСТИНА

Исследование клеток под микроскопом является ключевым методом клеточной биологии. Различные типы микроскопии, такие как световая микроскопия в широком поле или трансмиссионная электронная микроскопия позволяют оценить строение клетки и ее составляющих. Мечение специфическими маркерами дает возможность наблюдать отдельные белки и их локализацию. Это разнообразие методов служит для получения качественных результатов и иллюстративного материала, однако использование полученных изображений для статистической оценки часто затруднено отсутствием инструментов для автоматизации этого процесса. В данной работе продемонстрирована методика анализа фенотипа клеток в программе CellProfiler с последующей обработкой в RStudio. С помощью этой методики изучено изменение морфологии и плоидности кератиноцитов человека HaCaT и клеток карциномы человека A431 in vitro во время и после снятия воздействия индукторами стресса ЭПР бортезомибом (БТЗ) и дитиотреитолом (ДТТ). Индукция стресса ЭПР подтверждена методом ПЦР данными о повышении уровня экспрессии генов маркёров стресса ЭПР (GRP78, ATF4 и CHOP). Также показано, что экспрессия генов маркёров сохраняется и после снятия воздействия. Для анализа фенотипа клеток проведено окрашивание актиновых филаментов клеток фаллоидин-TRITC и ДНК ядер DAPI. На полученных фотографиях проведено измерение таких параметров как площадь, эксцентриситет и формфактор клеток, а также плоидность ядер клеток. Обнаружено, что в обеих культурах площадь снижается при воздействии БТЗ и ДТТ и возрастает после снятия воздействия обоими индукторами. Доля веретеновидных клеток в обеих культурах снижается при воздействии БТЗ и возрастает после снятия воздействия; доля веретеновидных клеток в обеих культурах также возрастает при воздействии ДТТ и снижается после снятия воздействия. Плоидность ядер клеток обеих культур возрастает во время и после снятия воздействия БТЗ; при воздействии ДТТ на клетки обеих культур плоидность ядер снижается, а после снятия воздействия ДТТ возрастает в клетках HaCaT и снижается в клетках A431. Таким образом, использование CellProfiler позволило выявить изменения фенотипических параметров клеток HaCaT и A431, а также провести оценку распределения этих изменений в составе популяций клеток. В дальнейшем это позволит определить причины фенотипического разнообразия, вызванного стрессом ЭПР.