ИСТИНА

Поисковые исследования новых ферментов – один из ключевых аспектов в биотехнологии сегодня. Они направлены на изучение биохимии микроорганизмов и поиск новых белков для различных биотехнологических задач. В нашей лаборатории активно исследуются оксидазы D-аминокислот (DAAO) из термофильных дрожжей Ogataea parapolymorpha DL-1. Это FAD-зависимые ферменты, катализирующие окисление D-аминокислот до альфакетокислот с выделением пероксида водорода и иона аммония. Основными направлениями для потенциального применения DAAO являются получение 7-аминоцефалоспорановой кислоты и детектирование D-аминокислот в биологических жидкостях и продуктах питания. Для биотехнологического применения ферменты должны иметь высокую термостабильность и хорошие каталитические параметры. Белки же необходимыми качествами зачастую не обладают и требуется их улучшение путем введения мутаций. Рациональный дизайн – один из подходов к введению подобных мутаций, позволяющий глубже понимать принципы работы и стабильности белков. И для его использования требуется знать структуру белка. Сегодня используются 3 основных метода определения структуры белков – рентгеноструктурный анализ (РСА), ядерно-магнитная спектроскопия и криоэлектронная микроскопия. Для различных DAAO, имеющих молекулярную массу мономера около 40 кДа, лучше всего подходит РСА. Для получения кристалла белка, который исследуют этим методом, требуется раствор белка высокой степени гомогенности в высокой концентрации (2-10 мг/мл). Одна из DAAO из дрожжей Ogataea parapolymorpha DL-1 (OpaDAAO1) имеет наибольшую каталитическую константу с D-Ala и необычный профиль pH-активности, но относительно высокую константу Михаэлиса с этим субстратом. В связи с этим интересно узнать пространственную структуру белка, чтобы проанализировать остатки, участвующие в связывании D-аминокислот при разных pH. В будущем это может быть использовано для изменения профиля pH-активности других оксидаз D-аминокислот. В ходе работы мы провели экспрессию OpaDAAO1 в клетках Escherichia coli BL21(DE3)pLysS CodonPlus. Выход с культивирования составил около 3,2 мг белка на грамм сырых клеток. Мы предложили ортогональную схему очистки на основе катионообменной и гель-проникающей хроматографии и оптимизировали условия их проведения. В итоговой очистке мы использовали следующие шаги: хроматография на SP Sepharose FF; концентрирование на Amicon Ultra-15; гель-фильтрация на TOYOPEARL HW-55; концентрирование на Amicon Ultra-15. Чистота получаемых препаратов белков проверялась спектрофотометрически и при помощи SDS-PAGE электрофореза. Степень очистки по оптимизированной методике составила более 40 при выходе в 7-9%. Полученный в ходе данной работы препарат фермента был успешно закристаллизован нашими коллегами из лаборатории инженерной энзимологии ФИЦ биотехнологии РАН.