ИСТИНА

Разработка ближне-инфракрасных (NIR) флуоресцентных белков (FPs) на основе бактериальных фитохромов (BphPs) в последнее время получила существенное развитие в связи необходимостью создания генетически кодируемых NIR зондов для прижизненной неинвазивной визуализации тканей и органов, а также взаимодействия белков в тканях млекопитающих. Природным хромофором бактериальных фитохромов является биливердин (BV), содержащийся в достаточных количествах в клетках животных. BV связанный с BphP поглощает и флуоресцирует в так называемом «оптическом окне прозрачности» тканей животных и человека, где уже практически не поглощают свет гемоглобин и меланин, а поглощение света молекулами воды еще незначительно. В настоящей работе исследованы спектральные свойства мутантных форм димерных флуоресцентных белков iRFP670, iRFP682 и iRFP713, имеющие цистеиновые остатки, способные связывать BV, как в PAS так и GAF доменах (Сys15 и Сys256, соответственно), имеющие цистеиновые остатки только в одном из доменов, и не имеющие этих цистеиновых остатков вовсе. Было показано, что спектральные свойства и прочность связывания хромофора определяются не столько принадлежностью белка к разным FPs, сколько локализацией цистеиновых остатков, способных связывать BV. Установлено что BV, встроенный в карман GAF домена и ковалентно связанный с Cys256 имеет более коротковолновые полосы поглощения и флуоресценции и более высокий квантовый выход по сравнению с BV, связанным ковалентно с Cys15 или с BV, встроенным в карман GAF домена, но не связанным с белком ковалентно. Обнаружено, что в белках с заменой Сys15Ser связывание молекулы BV с Сys256 в одном из мономеров аллостерически препятствует связыванию второй молекулы BV с Сys256 в другом мономере. Наличие Сys15 в PAS доменах оказывает существенное влияние на структуру GAF доменов, так что в этом случае BV связывается с Сys256 в GAF доменах обоих мономеров. Мутантные формы белков, содержащие два цистеиновых остатка Cys15 и Cys256, имеют наиболее узкие и самые коротковолновые спектры поглощения и флуоресценции, самый высокий квантовый выход флуоресценции и самую высокую молекулярную яркость. Наиболее высокая молекулярная яркость (в 1.5 и в 1.2 раза выше, по сравнению с iRFP713 и iRFP670, соответственно) обнаружена in vitro и в животных клетках для мутантной формы iRFP713/V256C.