ИСТИНА

Ближне-инфракрасные (NIR) флуоресцентные маркеры (FPs) на основе бактериальных фитохромов (BphPs) в комплексе с их природным лигандом, биливердином (BV), востребованы для прижизненной визуализации клеточных процессов в животных. NIR FPs обладают поглощением и флуоресценцией в ближне-инфракрасной области спектра, где ткани животных имеют наибольшую прозрачность из-за низкого фонового свечения тканей, меньшего светорассеяния и поглощения возбуждающего света. NIR FPs состоят из двух доменов, PAS и GAF, которые необходимы для связывания хромофора, при этом BV ковалентно связан с консервативным для природных BphPs остатком Cys в N-концевом участке PAS домена и встроен в карман GAF домена. Недавно, на примере белка BphP1-FP была показана возможность ковалентного присоединения BV к остатку Cys в консервативном -SPXH- участке GAF домена. Существенные для понимания спектральных свойств BphPs данные были получены при исследовании мутантных форм димерных NIR FPs, iRFP670, iRFP682 и iRFP713, имеющих цистеиновые остатки, способные связывать биливердин, как в PAS так и GAF доменах (Сys 15 и Сys 256, соответственно), имеющих эти цистеиновые остатки только в одном из этих доменов, и не имеющих этих цистеиновых остатков. Мы показали, что при взаимодействии димерных NIR FPs наблюдаются межмономерные и междоменные аллостерические эффекты, препятствующие или способствующие ковалентному связыванию BV. Исследование спектральных свойств мутантных форм мономерного NIR FP, BphP1-FP, с различной локализацией цистеиновых остатков позволило подтвердить данные, полученные для димерных NIR FPs. Интересной особенностью в структуре BphPs является наличие узла с 4-мя пересечениями полипептидной цепи, в формировании которого вовлечены PAS и GAF домены. Исследование процессов разворачивания-сворачивания димерных NIR FPs, с различной локализацией цистеиновых остатков, с которыми ковалентно связан хромофор, и NIR FPs, не способных связывать хромофор ковалентно, показало, что, вне зависимости от локализации остатка Cys, наличие ковалентно связанного хромофора и необходимость его упаковки в белковую глобулу препятствует правильному фолдингу белков данного класса и вызывает их агрегацию, узел не препятствует эффективному сворачиванию NIR FPs.