ИСТИНА

Флуоресцентные белки (FPs) и их улучшенные мутантные формы широко используются в качестве внутриклеточных репортерных зондов, белковых меток и молекулярных биосенсоров в фундаментальных исследованиях процессов жизнедеятельности клетки и в медицине. Огромное разнообразие спектральных свойств FPs определяется, в первую очередь, химическим различием структур хромофора, который образуется из трех собственных аминокислот в положении 65-67 и находится внутри белковой глобулы. FPs являются типичными представителями белков с топологией типа бета-бочонка. Жесткая структура бета-бочонка защищает хромофор от воздействия среды и ограничивает его подвижность, тем самым предотвращая безызлучательную дезактивацию возбужденного состояния хромофора. Взаимодействие хромофора с аминокислотами микроокружения оказывает влияние на спектральные свойства FPs. Синтез хромофора FPs становится возможным лишь после того, как сформирована нативная пространственная структура вокруг хромофор-образующих аминокислот и правильным образом расположены аминокислоты, катализирующие и направляющие синтез хромофора. Поэтому изучение процессов сворачивания FPs представляет большой интерес. В данной работе выполнено изучение процессов разворачивания–сворачивания зеленого флуоресцентного белка sfGFP (super folder GFP), под действием гуанидинтиоцианата (GTC) с использованием абсорбционной спектроскопии, собственной флуоресценции и флуоресценции зеленого хромофора и гель-хроматографии. Преимуществами sfGFP является его низкая склонность к агрегации и способность к рефолдингу. Было показано, что разрушение нативной структуры sfGFP при денатурации происходит в области концентраций GTC от 0.9 до 2.5 М и сопровождается синхронным изменением всех регистрируемых характеристик sfGFP. В области небольших концентраций денатуранта (менее 0.1–0.2 М) происходят локальные изменения структуры белка, о чем свидетельствуют результаты измерения параметра А, анизотропии флуоресценции и данные гельфильтрации. Незначительные структурные перестройки, тем не менее, сопровождаются существенным изменением интенсивности флуоресценции хромофора и триптофанового остатка sfGFP. Также заметно изменяется полоса поглощения sfGFP в видимой области спектра: существенно падает интенсивность поглощения анионной формы хромофора, и одновременно возрастает интенсивность поглощения нейтральной формы хромофора. Вероятно, эти эффекты обусловлены взаимодействием ионов денатуранта с группами белка. При изучении фолдинга белка ключевым моментом является изучение переходного состояния, т.е. определение аминокислот, взаимодействие между которыми происходит на ранних стадиях сворачивания белка и которые формируют ядро сворачивания. Для изучения ядра сворачивания sfGFP были созданы мутантные формы белка с заменами Val на Ala в положениях 22, 29, 55 и 68, ослабляющими гидрофобные взаимодействия. Было проведено изучение кинетики денатурации и ренатурации в широком диапазоне концентраций GTC, определены константы скоростей реакций и построены шевронные графики для мутантных форм sfGFP. Анализ шевронных графиков sfGFP и его мутантных форм показал, что остатки 22, 29 и 55 входят в ядро сворачивания.