ИСТИНА

В течение последних десятилетий наблюдается устойчивый рост числа людей, больных диабетом. Для предотвращения неблагоприятных последствий повышения уровня сахара в крови необходим его непрерывный или достаточно регулярный контроль. В связи с этим, актуальной является задача создания устройств, позволяющих непрерывно и неинвазивно измерять уровень глюкозы в крови человека. Перспективным направлением развития непрерывных методов мониторинга глюкозы является разработка биосенсорной системы, чувствительный элемент которой представлял бы собой белок, реакция которого с глюкозой носила бы обратимый характер. Для этих целей часто используются конканавалин А и D-глюкоза/D-галактоза-связывающий белок. Однако эти белки обладают относительно невысокой стабильностью. Мы предлагаем использовать в качестве чувствительного элемента биосенсорной системы на глюкозу высокостабильный трегалоза/мальтоза-связывающий белок (TMBP) из периплазмы термофильных бактерий Thermococcus litoralis. Этот белок помимо своих природных субстратов, способен связывать глюкозу с константой диссоциации комплекса белок–глюкоза 3-8 мМ. Собственная УФ флуоресценция ТМВР изменяется незначительно при взаимодействии этого белка с глюкозой. Поэтому, для регистрации взаимодействия ТМВР с глюкозой нами была исследована возможность использования флуоресцентных красителей, ковалентно присоединяемых к белку, Таким красителем является BADAN (6-бромацетил-аминонафталин). Присоединение BADAN к TMBP возможно только по цистеиновым аминокислотным остаткам. ТМВР содержит один собственный цистеиновый остаток, расположенный в активном центре белка. Нами не обнаружено изменения флуоресценции BADAN, присоединенного к дикому типу ТМВР при комплексообразовании этого белка с глюкозой. Это обусловлено тем, что цистеиновый остаток 182 расположен глубоко внутри лиганд-связывающего центра ТМВР и микроокружение этого остатка практически не изменяется при взаимодействии белка с глюкозой. Из анализа пространственной структуры ТМВР в комплексе с трегалозой, а также на основании знаний, полученных при работе с другими белками, следует, что наиболее перспективной областью для присоединения красителя являются периферийные участки активного центра ТМВР. В связи с этим были созданы мутантные формы ТМВР/C182S/A14C и ТМВР/C182S/A43C (замена С182S введена для исключения связывания BADAN c ТМВР по 182 положению). Для того, чтобы биосенсорная система непрерывно реагировала на изменения содержания сахара, константа диссоциации комплекса белок-глюкоза должна численно соответствовать искомому диапазону концентраций глюкозы. Константа диссоциации комплекса ТМВР/C182S/A14C-BADAN–Glc (3.4 мМ) соответствует концентрации глюкозы в крови здоровых людей (3 – 8 мМ). Мы рассматриваем мутантную форму TMBP/C182S/A14C с присоединенным флуоресцентным красителем BADAN как основу для создания серии меченых красителями мутантных форм ТМВР с различным сродством к глюкозе.