ИСТИНА

Оксидаза D аминокислот (DAAO, КФ 1.4.3.3) относится к классу FAD содержащих оксидоредуктаз и катализирует высокоспецифичное окисление D-аминокислот в соответствующие α кетокислот. Фермент играется важную роль в регуляции уровня D-аминокислот в живых организмах и находит широкое применение на практике. Он используется в аналитической биотехнологии для определения D аминокислот в различных образцах, в тонком органическом синтезе оптически-активных соединений, получении α кетокислот, неприродных L-аминокислот и окислении цефалоспорина С. Среди изученных оксидаз D аминокислот наилучшими свойствами изначально обладает фермент из дрожжей Trigonopsis variabilis (TvDAAO). Однако природный фермент имеет ряд недостатков, например, невысокую температурную стабильностью и широкий спектр субстратной специфичности, что затрудняет его эффективное применение в биотехнологии. Для получения TvDAAO с улучшенными свойствами может быть использован метод рационального белкового дизайна. Оксидаза D-аминокислот из Trigonopsis variabilis исследуется в нашей лаборатории с помощью метода рационального белкового дизайна уже в течение нескольких лет. За это время были получены мутантные формы фермента с измененным спектром субстратной специфичности и увеличенной температурной стабильностью. Однако изучение взаимосвязи структуры и функции фермента по-прежнему представляет большой интерес не только с практической, но и с теоретической точки зрения. В докладе будут представлены последние результаты, полученные в нашей лаборатории с помощью метода рационального дизайна, который включал в себя компьютерный анализ кристаллической структуры нативного фермента, докинг субстратов в активный центр, анализ аминокислотных последовательностей и компьютерное моделирование аминокислотных замен. В результате такого скрининга были выбраны наиболее перспективные замены в области активного центра фермента и получены новые мутантные TvDAAO с измененными свойствами. В докладе будет рассмотрено влияние введенных мутаций на каталические свойства и температурную стабильность TvDAAO, а также возможность применения новых мутантных форм фермента в биотехнологии. Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 11-04-00959-а) и Фонда содействию развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере (грант У.М.Н.И.К., контракт 10255p/16855).