ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИПМех РАН |
||
У теплокровных животных α-и β-глобиновые гены расположены на разных хромосомах и их экспрессия регулируется с привлечением разнящихся механизмов, в частности, экспрессия α-глобиновых генов теплокровных находится под контролем главного регуляторного элемента(αMRE), который лежит на значительном расстоянии от глобиновых генов в интроне соседнего гена домашнего хозяйства NPRL3. У холоднокровных животных α-и β-глобиновые гены соседствуют, причем, оставаясь сцепленными друг с другом, могут быть расположены в двух локусах. В главном локусе тропической рыбы Danio rerio слитый домен α-и β-глобиновых генов подразделяется на два субдомена, эмбрионально-личиночный и взрослый, различающихся по времени экспрессии в индивидуальном развитии. Кластеризованные α-и β-глобиновые гены Danio rerio соседствует с геном C16orf35, который является гомологом консервативного гена домашнего хозяйства NPRL3 высших позвоночных. В пятом интроне этого гена был обнаружен главный регуляторный элемент (MRE), который является эритроид-специфическим энхансером домена слитых α-и β-глобиновых генов, однако, роль MRE в регуляции экспрессии отдельных глобиновых генов и отдельных субдоменов не продемонстрирована. Целью работы является изучение роли MRE в регуляции транскрипции глобиновых генов, экспрессирующихся на разных стадиях. Экспериментальная задача состоит в оценке уровня промоторной активности геномных элементов, расположенных между α-и β-глобиновыми генами главного локуса Danio rerio и изучении энхансерной активности MRE по отношению к промоторам глобиновых генов, расположенных в разных субдоменах. Функциональную активность геномных элементов оценивали в экспериментах по определению уровня транскрипции репортерного гена, находящегося под контролем исследуемых участков домена в составе транзиентно трансфецированных генетических конструкций. Было показано, что геномные элементы , расположенные между взрослыми и эмбриональными α-и β-глобиновыми генами, обеспечивают значительное увеличение транскрипции репортерного гена люциферазы по сравнению с контролем, т.е. обладают выраженной промоторной активностью. Изменение ориентации двунаправленных промоторов в большинстве случаев не влияло на уровень экспрессии репортерного гена. Продемонстрировано, что MRE повышает активность всех исследуемых промоторов в составе конструктов, т.е. является энхансером. Максимальную энхансерную активность MRE проявлял в отношении одного из взрослых двунаправленных промоторов, тогда как в отношении всех эмбриональных промоторов активность была менее выраженной. Это позволило предположить, что эмбриональный и взрослый субдомены разделены регуляторным элементом, модулирующим активность MRE. Таким элементом мог быть потенциальный сайт связывания одного из инсуляторных белков (CTCF), расположенный на границе субдоменов перед первым эмбриональным геном. Мы показали, что делеция этого элемента приводила к увеличению уровня экспрессии репортерного гена в составе конструкта. Таким образом, был проведен функциональный анализ регуляторных геномных элементов слитого домена α-и β-глобиновых генов Danio rerio. Охарактеризован ряд однонаправленных и двунаправленных промоторов взрослых и эмбриональных генов. Кроме того, была продемонстрирована энхансерная активность MRE в отношении промоторов глобиновых генов эмбрионального и взрослого субдоменов. Был обнаружен регуляторный элемент, возможно, вовлеченный в переключение эритропоэза с эмбрионально-личиночного на взрослый тип.