ИСТИНА

Пирофосфат (PPi) является побочным продуктом около 200 биосинтетических реак-ций, в которых нуклеозидтрифосфаты превращаются в нуклеозидмонофосфаты и PPi. Будучи продуктом этих реакций, PPi ингибирует многие из них и поэтому является важнейшим клеточным регулятором. Поскольку PPi не вступает в метаболические процессы, его уровень регулируется в большинстве клеток посредством гидролиза до метаболизируемого фосфата под действием фермента – неорганической пирофосфатазы. Наиболее интересна регулируемая разновидность этого фермента (CBS-РРаза), которая имеет дополнительную регуляторную часть, образованную парой CBS-доменов и DRTGG-доменом, в виде вставки в один из каталитических доменов (DHH). Активный центр находится между DHH- и DHHA2-доменами. CBS-РРаза аллостерически активируется или ингибируется адениновыми моно- и динуклеотидами (AMP, ADP, ATP, диаденозинполифосфаты и др.). Эти лиганды связываются с CBS-доменами с наномолярной или микромолярной аффинностью, чаще всего кооперативно. Известно, что CBS-РРаза образует гомотетрамер, однако, его пространственная структура пока не поддается определению прямыми методами. Используя подходы моделирования структуры (Modeller, последняя версия Al-phafold2), молекулярной динамики, сайт-направленного мутагенеза и стационарной кинетики, мы получили модель структуры тетрамера CBS-РРазы, которая адекватно описывает эффекты регуляторных лигандов. Эта модель предполагает, что DHHA2-домен создает внутреннее напряжение, которое деформирует активный центр, при образовании тетрамера CBS-РРазы и поэтому является ключевым звеном в передаче сигнала из регуляторного центра в активный. Связывание регуляторных лигандов увеличивают или уменьшает это напряжение и деформацию активного центра, что изменяет активность CBS-РРазы. Сравнение полноразмерной CBS-РРазы и ее делеционного варианта без DHHA2-домена методами изотермической калориметрии, флуоресценции и молекулярной динамики подтвердило механизм регуляции фермента, предложенный на основании структурного анализа. Нуклеотид-связывающие CBS-домены входят в состав многих белков, в том числе имеющих медицинскую значимость. Данные, полученные для CBS-РРазы, будут способствовать выяснению их регуляторных механизмов и возможных путей влияния на них. Кроме того, они открывают возможность применения CBS-доменов для направленного дизайна белков с регулируемой функцией.