ИСТИНА

Ферменты находят все более широкое применение в промышленности. Однако практическое использование биокатализаторов в промышленности часто сопряжено с рядом проблем. В частности, с низкой стабильностью фермента в реакционной среде. Поэтому ферменты, перспективные для использования в промышленной биотехнологии, должны обладать свойствами, обеспечивающих экономическую целесообразность их использования. Одним из таких свойств является операционная стабильность ферментов. Для ферментов операционная стабильность определяется относительной активностью фермента во время его использования. В нашей лаборатории проводятся исследования взаимосвязи структуры и функции оксидазы D-аминокислот из дрожжей Trigonopsis variabilis (TvDAAO), а также получение мутантных форм фермента со свойствами, оптимизированными для использования в промышленной биотехнологии. Наиболее крупномасштабным производством с использованием TvDAAO является процесс получения 7-аминоцефалоспорановой кислоты (7-АПК) из цефалоспорина C. 7-АПК является исходным ядром для синтеза цефалоспоринов различных поколений. В результате реакции, катализируемой TvDAAO, образуется пероксид водорода, который инактивирует фермент. Целью в данной работы было проведение экспериментов по белковой инженерии для получения мутантных форм TvDAAO, устойчивых к действию пероксида водорода. Известно, что в белках наиболее подвержены окислению остатки метионина и цистеина. Поэтому было решено изучить влияние замен ряда остатков метионина и цистеина на устойчивость к действию пероксида водорода [1]. Был проведен анализ структуры TvDAAO и проведено множественное выравнивание аминокислотных последовательностей оксидаз D-аминокислот из различных источников. В результате были выбраны наиболее перспективные замены. Были получены плазмиды с мутациями в гене tvdaao, кодирующими соответствующие аминокислотные замены. Мутантные ферменты были экспрессированы в клетках E.coli, выделены в высокоочищенном состоянии и охарактеризованы. В результате были получены мутантные формы TvDAAO с увеличенной стабильностью к действию пероксида водорода по сравнению с TvDAAO дикого типа. Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (грант 16-14-00043).