ИСТИНА

Трансаминазы (ТА) – это пиридоксаль-5’-фосфат (PLP)-зависимые ферменты, катализирующие стереоселективный и обратимый перенос аминогруппы с аминокислоты / амина на кетокислоту / кетон с образованием новых амино и кетосоединений. По типу укладки PLP-связывающего домена ТА относятся к I и IV типам. По типу субстратной специфичности ТА IV типа включают три подсемейства: трансаминазы D-аминокислот (DAAT, D-amino acid aminotransferase), трансаминазы разветвленных L-аминокислот (BCAT, branched-chain amino acid aminotransferase) и трансаминазы (R)-аминов (R-TA, (R)-amine:pyruvate transaminase). Субстратная специфичность ТА определяется свойствами аминокислотных остатков, образующих активный центр. Для всех трех вышеперечисленных подсемейств были описаны характеристические мотивы аминокислотных последовательностей, определяющие специфичность ТА. В данной работе охарактеризована ТА из Blastococcus saxobsidens (Blasa), характеристические мотивы которой отличаются от описанных ранее. Синтетический ген Blasa клонировали в плазмиду pET-21d, рекомбинантную форму фермента экспрессировали в клетках E. coli с His-tag на N-конце и выделяли с помощью металл- хелатной хроматографии. В результате анализа каталитических свойств Blasa было установлено, что фермент активен как в реакциях с D-аминокислотами, так и в реакциях с первичными (R)- аминами. Переаминирование D-аминокислот характеризуется pH-оптимумом 8–9, деаминирование первичных (R)-аминов оптимально при рН 9. Температурный оптимум реакций с D-аминокислотами составил 40 °С, реакций с первичными (R)-аминами — 30 °С. При этом активность Blasa в реакциях с (R)-аминами ниже, чем в реакциях с D- аминокислотами. Для реакций D-Glutamate + Pyruvate и (R)-1-phenylethylamine + Pyruvate, катализируемых Blasa, kcat составили 7.5 ± 0.3 с–1 и 0.074 ± 0.003 c–1, соответственно. Проанализирована термостабильность Blasa в рабочих буферах (50 мМ К-фосфат, рН 8.0 и 50 мМ CHES pH 9.0), операционная стабильность Blasa в присутствии субстратов, а также влияние добавок на стабильность фермента. Обнаружено, что в рабочих условиях через 65 часов остаточная активность Blasa без добавок составила 20 %, в присутствии 10 % ДМСО — 80 %, а в присутствии 10 и 20 % глицерина — 10 %.