ИСТИНА

Метилирование CpG-сайтов в ДНК является эпигенетической модификацией генома, которая играет важную роль в регуляции экспрессии генов. ДНК-метилтрансфераза (МТаза) Dnmt3a создает в геноме de novo определенный «рисунок» метилирования, нарушение которого сопряжено с развитием злокачественных заболеваний. Согласно данным рентгеноструктурного анализа каталитического домена Dnmt3a (Dnmt3a-CD), активной формой Dnmt3a является тетрамер с двумя каталитическими центрами, расположенными на расстоянии витка двойной спирали ДНК. Остается открытым вопрос, может ли фермент метилировать оба остатка цитозина, локализованные в соседних CpG-сайтах за один акт связывания. 6-тиогуанин (SG) является эффективным противораковым препаратом, который встраивается в ДНК и может присутствовать в СрG-сайтах вместо остатка G. Механизм влияния этого повреждения на функционирование Dnmt3a-CD не изучен. Целью настоящей работы стало исследование конформационных переходов в фермент-субстратном комплексе при взаимодействии Dnmt3a-CD мыши с ДНК, содержащими SG в одном или двух CpG-сайтах (SG-ДНК). Сконструированы 30-звенные ДНК с одним или двумя полуметилированными CpG-сайтами (в каждый сайт уже введена одна метильная группа), расположенными на расстоянии 9-ти нуклеотидных пар, и соответствующие поврежденные SG-ДНК. Методом поляризации флуоресценции показано, что фермент эффективно связывается с неповрежденными двухсайтовыми субстратами, независимо от расположения метильных групп (в одной или в разных цепях ДНК) и от присутствия полностью метилированного сайта. Не наблюдалось зависимости уровня метилирования от локализации уже введенных метильных групп в соседних CpG-сайтах. Вероятно, только один активный центр фермента вовлечен в каталитический акт. Эта информация важна для установления правильного «рисунка» метилирования в клетках. Dnmt3a-CD эффективно связывается с SG-ДНК, содержащими остаток SG-ДНК в СрG-сайте, рядом с ним или в удаленной от СрG-сайта позиции. Вместе с тем, наблюдается небольшое увеличение константы диссоциации (Kd) комплексов SG-ДНК/ Dnmt3a-CD (в 1,7 и 2,4 раза при наличии SG в одном или двух СрG-сайтах, соответственно). С учетом этих данных причина ухудшения эффективности метилирования, наблюдаемая в нашей лаборатории ранее в случае SG-ДНК, может быть связана с нарушением важного для образования каталитически компетентного фермент-субстратного комплекса контакта атома кислорода О6 остатка гуанина с МТазой Dnmt3a-CD при замене этого кислорода на атом серы. Другой причиной ухудшения метилирования может быть нарушение необходимых структурных перестроек ДНК-субстратав процессе реакции при введении sG. Для решения этого вопроса воспользовались методом кругового дихроизма (КД) в области поглощения sG, прозрачной для белков и ДНК. С помощью модельной прокариотической МТазы M.SssI разработаны условия использования sG как спектроскопической метки для изучения происходящих в ДНК-белковых комплексах конформационных изменений ДНК. Поддержано грантом РФФИ 13-04-00727.