ИСТИНА

Стрептококк групп А и С и золотистый стафилококк являются возбудителями опасных заболеваний внутренних органов, кожных покровов и горла. Ежегодно в России эти заболевания поражают сотни тысяч (стафилококк) и миллионы (стрептококк) человек, большое количество случаев имеют летальный исход. Лечение антибиотиками теряет свою актуальность, так как 30% штаммов стрептококка группы А и 90% штаммов золотистого стафилококка к ним устойчивы. Изучаемый в данной работе фермент PlyC способен лизировать клетки стрептококков групп А, С и Е, а фермент LysK – клетки Staphylococcus aureus, в том числе штаммы, резистентные к метициллину и ванкомицину. Эти ферменты имеют перспективы для применения в качестве средств гигиены полости рта (лечение ангин, тонзиллитов), средств для внутреннего введения на ранних и поздних стадиях развития инфекций, средств для лечения заболеваний кожных покровов (рожа, фурункулы, нагноения). Основными проблемами, препятствующими использованию этих ферментов в медицинских целях, являются их не изученность как биокатализаторов: в литературе в принципе отсутствуют какие-либо кинетические данные и низкая стабильность в условиях хранения. Таким образом, целью данной работы являлось исследование физико-химических свойств и разработка лекарственных препаратов нового поколения на основе ферментов бактериофагов для лечения заболеваний, вызываемых стрептококком групп А и С и золотистым стафилококком. Для фермента LysK методами кинетических измерений, седиментации, нативного и SDS электрофореза показано, что зависимости остаточной активности от времени описываются уравнением второго порядка в интервале температур 20 - 40°С, рН 6-9, интервале концентраций 0.05 – 0.5 мг/мл, т.е. в широком диапазоне условий. LysK обладает низкой для медицинского препарата стабильностью: в условиях испытаний при 37ºС (ускоренная инактивация) фермент теряет 50% активности в течение 5-6 часов, при 22ºС (температура хранения) за 6-7 дней. Известно, что агрегацию белковых молекул можно подавить добавлением полиэлектролитов. Для этой цели использовали поликатионы, такие как полибрен, полилизины, полиэтиленимины различных молекулярных масс, а также их блок-сополимеры с полиэтиленгликолем. Все без исключения поликатионы проявляли стабилизационный эффект, который был наиболее ярким при использовании полибрена. Для увеличения числа электростатических контактов молекул фермента и полибрена, отрицательный заряд молекулы LysK был увеличен путем модификации аминогрупп фермента янтарным ангидридом. При увеличении степени модификации молекулы LysK янтарным ангидридом до 70% и при увеличении содержания полибрена можно добиться уменьшения констант инактивации в 500 раз и увеличения времен полуинактивации в 1000 раз по сравнению с ферментом без добавок. Химическая иммобилизация LysK была осуществлена за счет пришивания его молекул к поверхности полимерных носителей: полиальдегида и полилизина. Процессы контролировали при помощи метода SDS электрофореза. Иммобилизованный таким образом фермент сохранял 40 – 60% активности и был в несколько раз стабильнее не иммобилизованного фермента. Установлено, что при температурах 22 и 37ºС фермент PlyC инактивируется по диссоциативному механизму. Основным способом стабилизации PlyC было включение в мицеллярно-полиэлектролитные композиции, содержащие полиакриловую кислоту, глицерин, неионогенные ПАВ бридж 30 и Плюроник ф 127, и декстраны, которые по отдельности положительно влияют на стабильность фермента. В композиции М16 фермент сохраняет 100% активности в течение 2 месяцев хранения при указанных выше температурах. При испытаниях на живых клетках было показано, что композиции без фермента не эффективны и что при использовании только фермента при посеве клеток, отобранных из зоны лизиса, есть колонии. У фермента в составе композиций таких эффектов нет. Показано, что при хранении фермента в композиции М16 число колоний после пересева равно 0 в течение 2 месяцев. Таким образом, стабильность и эффективность действия стабилизированных при помощи полиэлектролитов препаратов обоих ферментов удовлетворяет требованиям к медицинским препаратам.