ИСТИНА

Губки (Porifera) – водные, морские или пресноводные многоклеточные животные с фильтрационным питанием и дыханием. У губок отсутствуют обособленный кишечник или кишечная паренхима, нервная и мышечная системы, а также гонады. Организация этих многоклеточных животных во взрослом состоянии крайне примитивна, и единственной обособленной системой, вокруг которой строится вся организация взрослой губки, является водоносная система. Уникальной чертой взрослых губок можно считать мобильность и пластичность их анатомических структур и клеточных линий. Все клетки в теле этих животных способны к активному перемещению, и среди них нет необратимо дифференцированных типов. Анатомические структуры в теле губки также подвергаются постоянной перестройке. Эти непрерывно идущие процессы реорганизации тела позволяют губкам адекватно реагировать на изменения условий окружающей среды (Ересковский, 2005). Одной из форм проявления описанной выше пластичности губок является способность их клеток к реагрегации после диссоциации тканей животного химическими или механическими методами. В ходе реагрегации происходит формирование многоклеточных агрегатов разнообразного строения, а в некоторых случаях и полное восстановление организации губки (с функционирующей водоносной системой, непрерывной экзопинакодермой и развитым мезохилом) (Wilson, 1907; Buscema et al., 1980; Короткова, 1972). Особой стадией процесса реагрегации является формирование так называемых примморфов. Приммморфы представляют собой трехмерные клеточные агрегаты сферической формы. Они обладают тканеподобной структурой и характеризуются наличием непрерывной пинакодермы, отделяющей внутреннюю массу неспециализированных клеток от окружающей среды. Примморфы представляют собой завершение процесса реагрегации клеток. После их окончательного формирования могут начаться процессы регенерации и роста губки (Custudio et al., 1998; Müller et al., 1999). Все это делает процесс реагрегации клеток губок удобной лабораторной моделью, которая позволяет в контролируемых условиях изучать поведение отдельных типов клеток (клеточные деления, миграция, дифференцировка, роль программируемой клеточной смерти), а также процессы восстановления исходных связей между клетками и формирования основных структурных элементов организма. Целью настоящего исследования было отработать методику и проанализировать последовательность стадий реагрегации клеток у двух видов губок из Белого моря, ранее не использовавшихся в подобных работах. Работы была проведена на базе Беломорской биостанции им. Н.А. Перцова биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова. В качестве объектов исследования были выбраны два вида губок, относящиеся к классу Demospongiae: Halichondria panicea (Pallas, 1766) и Haliclona aquaeductus (Shmidt, 1862). Сбор образцов проводили легководолазным методом. До начала экспериментов губок содержали в аквариумах с биологическими фильтрами при температуре 12-15°С. Затем участки тела губок подвергали механической диссоциации: измельченные кусочки тканей помещали протирали сквозь мельничный газ (размер ячеи 200 мкм) с помощью пинцета в емкость с фильтрованной морской водой. Полученные суспензии клеток культивировали при постоянной температуре 4°С (первые 24 часа культивирование проходило на орбитальном шейкере при скорости вращения 100 об/мин). В качестве среды для культивирования суспензии клеток использовали фильтрованную морскую воду. Процесс реагрегации регистрировали под микроскопом или бинокуляром. Клеточные агрегаты, сформировавшиеся в суспензиях клеток, были зафиксированы и исследованы методами световой и электронной микроскопии (ТЭМ, СЭМ). Суспензии клеток изученных видов губок, полученные при диссоциации тканей животных, содержали живые клетки. Большинство клеток активно образовывало псевдоподии. Количество и форма псевдоподий варьировали. Окраска суспензий йодидом пропидия в комбинации с DAPI показала, что они содержали лишь небольшое количество мертвых клеток. Первые этапы процесса реагрегации начинаются в суспензиях клеток непосредственно после их получения. Нам не удалось наблюдать амебоидного перемещения клеток в суспензии с помощью псевдоподий. Судя по всему, клетки образуют псевдоподии для “обследования” пространства вокруг себя. При соприкосновении псевдоподий двух клеток, между ними возникает контакт, и клетки начинают сближаться друг с другом за счет сокращения псевдоподий. Вероятно, именно таким образом происходит образование первых клеточных агрегатов у исследованных видов. Клетки в составе первых агрегатов также образуют псевдоподии, что способствует присоединению к агрегатам новых клеток и увеличению их размеров. Процесс реагрегации клеток у исследованных видов губок в целом проходит сходно, и в нем можно выделить несколько этапов: 1) формирование первичных клеточных агрегатов; 2) сортировка клеток в составе первичных клеточных агрегатов; 3) преобразование первичных клеточных агрегатов в примморфы; 4) активное слияние примморфов друг с другом. Через 24 часа после диссоциации, в суспензиях клеток происходило формирование первичных клеточных агрегатов, заметных невооруженным глазом. В суспензиях клеток H. panicea при концентрации 107 кл/мл происходит формирование большого количества некрупных клеточные агрегатов диаметром 140 185 мкм, которые имеют округлую или сложную разветвленную форму. В суспензиях H. aquaeductus при концентрации клеток 107 кл/мл появляется не только большое количество простых клеточных агрегатов, но и крупные клеточные скопления. Агрегаты имеют округлую или овальную форму и достаточно крупные размеры – 250-497 мкм в диаметре. Клеточные скопления представляют собой очень крупные образования размером до 10 мм, имеющие неправильную форму. Форма и плотность таких скоплений сильно варьирует в разных культурах клеток. Клеточные скопления могут долгое время существовать в культуре, при этом на их поверхности появляется большое количество мертвых клеток и детрита. Со временем такие скопления погибают. Изучение полутонких срезов показало, что клеточные агрегаты обоих видов губок состоят из клеток двух размерных классов. Большая часть клеток в составе агрегатов имеет размеры 2-5 мкм и, вероятно, происходит от хоаноцитов и пинакоцитов. Но присутствуют и более крупные клетки (8 20 мкм), образовавшиеся из разнообразных клеток мезохила. Большинство крупных клеток несет в цитоплазме многочисленные фагосомы. Реже встречаются крупные клетки, в цитоплазме которых находятся включения с гомогенным содержимым. Клетки в составе агрегатов разделяют пустые пространства, которые у живых агрегатов, вероятно, заполнены внеклеточным матриксом. На ультратонких срезах между цитоплазматическими мембранами некоторых контактирующих клеток были обнаружены межклеточные контакты, морфологически напоминающие контакты запирающего типа. На 3-4–е сутки культивирования начинается следующий этап процесса реагрегации – сортировка клеток в составе первичных клеточных агрегатов. Внешне это проявляется в формировании вокруг большинства агрегатов рыхлой оболочки из мертвых клеток и детрита. После освобождения агрегатов от такой оболочки (на 5-8–е сутки) они выглядят более плотными, приобретают правильную округлую форму. Данную стадию реагрегации клеток изученных видов губок можно охарактеризовать как ранние примморфы. В течение следующих двух суток следует преобразование ранних примморфов в настоящие примморфы, сопровождающееся формированием у них более гладкой поверхности. На гистологическом уровне сортировка клеток приводит к уменьшению количества мелких клеток (размером 2 5 мкм) в составе агрегатов и к уплотнению упаковки оставшихся более крупных клеток. В составе ранних примморфов обоих видов губок преобладают клетки размером 8-20 мкм. Поверхность ранних примморфов H. aquaeductus покрыта слоем клеток амебоидной формы, соединенных большим количеством цитоплазматических отростков и имеющих слегка уплощенную форму. У ранних примморфов H. panicea такой слой клеток отсутствует. У H. aquaeductus преобразование ранних примморфов в настоящие примморфы сопровождается формированием на их поверхности пинакоцитов. Тем не менее, пинакоциты не образуют сплошного слоя на поверхности примморфов данного вида: встречаются лишь отдельные пинакоциты, большая часть клеток поверхности имеют амебоидную форму и несет большое количество сильно разветвленных псевдоподий. Это отличает примморфы H. aquaeductus от примморфов Suberites domuncula, для которых рядом авторов описывается поверхность, покрытая непрерывным слоем пинакоцитов (Custudio et al., 1998; Müller et al., 1999). При формировании настоящих примморфов H. panicea на их поверхности не появляются пинакоциты, но формируется слой гладкого внеклеточного матрикса. В остальных чертах своего строения примморфы похожи на ранние примморфы. Примморфы были последней стадией реагрегации у исследованных видов губок. После завершения своего формирования примморфы сохраняли жизнеспособность более месяца, но восстановления исходной организации губки не происходило. В течение этого времени наблюдали постепенное слияние примморфов и увеличение их размеров. За семь дней после завершения формирования примморфов в культурах H. aquaeductus их размеры увеличились с 177 мкм до 614 мкм. В культурах H. panicea в тот же период времени размеры примморфов увеличились с 136 мкм до 275 мкм. Данная работа позволила отработать методики получения клеточных агрегатов из суспензий клеток губок и определить основные этапы процесса реагрегации клеток у двух видов беломорских губок. Это послужит основой для более детальных исследований процесса реагрегации. Предстоит изучить роль и поведение различных типов клеток, формирование новых межклеточных контактов и восстановление внеклеточного матрикса и скелетных элементов в ходе этого процесса. How to cite: Lavrov A and Kosevich I. Cell reaggregation process in two species of White Sea sponges [version 1; not peer reviewed]. F1000Research 2017, 6:1049 (slides) [Russian] (doi: 10.7490/f1000research.1114349.1)