ИСТИНА

Оксидаза D-аминокислот (КФ 1.4.3.3, DAAO) участвует в регуляции нервной деятельности и других процессов. Например, снижение в спинно-мозговой жидкости концентрации D-Ser за счет повышенной активности DAAO является одной из причин возникновения шизофрении. В случае ряда нейродегенеративных заболеваний (НДЗ) (Альцгеймера, Паркинсона и др ) также наблюдается повышение уровня D-Ala. Поэтому разработка экспресс-методов определения D-аминокислот для диагностики НДЗ является актуальной проблемой медицинской диагностики, однако широкая субстратная специфичность природных DAAO не позволяет создать селективные сенсоры. Ряд оксидаз D-аминокислот используется на практике в тонком органическом синтезе. Особо следует выделить фермент из дрожжей Trigonopsis variabilis (TvDAAO), которая используется в крупнотоннажном биферментном биокаталитическом процессе получения из цефалоспорина С 7-аминопенициллановой кислоты. Впервые TvDAAO была описана еще в 1994 году, однако кристаллы этого фермента так и не были получены, что не позволяло использовать метод рационального дизайна. В нашей лаборатории был клонирован ген TvDAAO и создана высокоэффективная система его экспрессии в клетках E.coli. Нами были проведены систематические исследования взаимосвязи структура-функция. Было показано, что при разных концентрациях его олигомерное состояние меняется от неактивного мономера до олигомеров более высокого порядка. На основании построенной модели 3D-структуры был получен ряд мутантов, один из которых удалось закристаллизовать. Используя полученную структуру был проведен докинг субстратов в активный центр. Были выбраны наиболее перспективные положения для введения замен и проведено компьютерное моделирование возможных мутантов. После отбора наиболее перспективных вариантов были получены мутантные TvDAAO, у которых была повышена стабильность, каталитическая активность с цефалоспорином С или с узким спектром субстратной специфичности (например, активный с D-Ser и неактивный с D-Ala и наоборот). Точечные замены были объединены в многоточечные (до 4 замен) мутанты, которые аддитивно объединили положительные эффекты предшественников. Обсуждается роль отдельных замен на свойства фермента. Работа выполнена при поддержке гранта РНФ 16-14-00043.