ИСТИНА

Энтоз впервые был включен в список различных вариантов программированной клеточной гибели в 2009 году Комитетом по Номенклатуре Клеточной Гибели. Он вызывается потерей контакта с матриксом, приводящей к внедрению одной клетки внутрь другой за счет акто-миозинового сокращения. Результатом энтоза, как правило, является лизосомо-опосредованная деградация внедрившейся клетки. Однако эти данные получены на клетках, находящихся в суспензионном состоянии (Overholtzer et al, 2007) . Целью нашей работы явилось исследование роли цитоскелета и аппарата Гольджи, участвующих в везикулярном транспорте, в процессе энтоза в субстратзависимых культурах А431 (эпидермоидная карцинома человека) и MCF-7 (аденокарцинома молочной железы человека). В работе использованы методы световой, DIC (дифференциально-интерференционный контраст), флуоресцентной, конфокальной микроскопии, трансмиссионной и сканирующей электронной микроскопии (ТЭМ и СЭМ). В обеих культурах обнаружены картины “клетка-в-клетке”. С помощью конфокальной микроскопии и СЭМ мы доказали, что одна клетка действительно находится внутри другой клетки. На основании этих данных предложен следующий гипотетический механизм внедрения одной клетки в другую: после открепления от субстрата клетка прикрепляется к другой клетке и начинает продавливать плазматическую мембрану (ПМ) последней, в результате чего оказывается погруженной в глубокую впадину (кратер) в теле клетки-каннибала. После этого клетка-каннибал формирует псевдоподию, которая закрывает данный кратер сверху. Известно, что во внедрении клетки в клетку в суспензионных культурах участвует актиновый цитоскелет (Overholtzer et al, 2007). Нами выявлено, что в субстратзависимых культурах А431 и MCF-7 на ранних стадиях энтоза в местах контакта внедрившейся клетки и клетки-каннибала присутствуют области с высоким содержанием актина. На клетках линии А431 обнаружено, что воздействие цитохалазином В, нарушающим сборку актиновых микрофиламентов, приводит к полному исчезновению клеток- каннибалов через 48 часов. Однако этот эффект обратим: при отмывке от цитохалазина В в культуре вновь появляются клетки-каннибалы через 4-7 часов, через 24 часа уровень клеточного каннибализма (КК) достигает контрольного значения и через 48 часов превышает эти значения. Отсюда можно сделать вывод, что нарушение реорганизации актинового цитоскелета подавляет процессы КК. Кроме того, данный эксперимент позволяет синхронизировать начало внедрения одной клетки в другую в культуре. При исследовании распределения микротрубочек мы обнаружили, что в клетках-каннибалах на начальных этапах энтоза они располагаются в виде плотных тяжей вокруг внедрившейся клетки. После длительной обработки клеток А431 нокодазолом (более 8 часов), разрушающим микротрубочки, начальные стадии энтоза не обнаруживаются, и в конечном итоге (через 15 и более часов) число случаев КК снижается до нуля. Следовательно, можно предположить, что в процессах внедрения одной клетки в другую участвует не только актиновый цитоскелет, но и система микротрубочек. С помощью СЭМ мы также показали, что после обработки культуры нокодазолом внедряющаяся клетка образует кратер в клетке-каннибале. Последняя при этом не формирует псевдоподию. Вероятно, для образования псевдоподии необходимо увеличение площади поверхности ПМ клетки-каннибала, которое обеспечивается за счет везикулярного транспорта по микротрубочкам. Чтобы проверить данную гипотезу, мы воздействовали брефелдином А (ингибитором транслокации белков из эндоплазматического ретикулума в аппарат Гольджи) на клетки А431, синхронизированные с помощью цитохалазина В. По сравнению с контрольными клетками (отмытыми после 48-часового воздействия цитохалазином В) в популяции клеток с брефелдином А на всех сроках (5, 8, 15, 19 и 24 часа) встречались лишь единичные клетки-каннибалы. С помощью метода прижизненного наблюдения мы проследили за судьбой внедрившейся клетки. Как правило, последняя подвергается деградации, сопровождающейся активацией кислого везикулярного компартмента в обеих клетках-участницах КК. Параллельно происходит перераспределение аппарата Гольджи (АГ) и митохондрий в клетке-каннибале. Известно, что АГ является источником лизосом в клетке. Однако воздействие брефелдином А существенно не повлияло на активацию кислого везикулярного компартмента и деградацию внутренной клетки за счет уже имеющихся лизосом. Разборка микротрубочек при действии нокодазола также не препятствовала этому процессу. Таким образом, можно предположить, что для внедрения одной клетки в другую необходима активность актиновых филаментов, микротрубочек и работа АГ по продукции мембранных везикул, участвующих в изменении формы клеток и в увеличении площади поверхности ПМ клетки-каннибала. Однако микротрубочки и активность АГ не играет значительной роли в лизосомо-опосредованной деградации внедрившейся клетки.