ИСТИНА

Камчатский краб (КК), лат. Paralithodes camtschaticus – коммерчески важное ракоообразное, обитающее в Беринговом и Баренцевом морях при экстремально низких температурах, близких к 0оС. Его основной пищеварительный орган, гепатопанкреас, богат психрофильными протеиназами, некоторые из них были ранее описаны, на их основе получен коллагенолитический препарат «Морикраза». Из него же был выделен белковый ингибитор протеиназ, который был отнесен к классу серпинов, суперсемейству белков, обладающих уникальным механизмом необратимого суицидального ингибирования. При помощи данных N-концевого секвенирования и поиска в базах данных из библиотеки кДНК гепатопанкреаса камчатского краба была получена первичная структура, обладающая характерными для представителей этого семейства элементами. Функциональный рекомбинантный белок был получен путём оверэкспрессии в E. сoli и ренатурации из телец включения с предварительным подбором условий. С целью выяснить его специфичность было проверено его взаимодействие с различными сериновыми и цистеиновыми протеазами, такими как тромбин, протеиназа К, катепсин Б, химотрипсин, трипсин, папаин, субтилизин А, из которых только с трипсином серпин PC взаимодействует по ингибиторному пути, с образованием ковалентного, устойчивого комплекса протеиназа-ингибитор. Это взаимодействие было охарактеризовано кинетически: стехиометрия ингибирования (SI, SI = (k4+k3)/k4) составила 4.7 ± 0.8, k2 = 0.049 ± 0.019 s-1, Ki = 21 ± 10 nM, а общая константа ассоциации второго порядка kass = (2.3 ± 0.7)x106 M-1s-1. Для того чтобы прояснить роль серпина PC в организме КК было исследовано распределение его транскрипта и зрелого белка по тканям, методами ОТ-ПЦР в реальном времени и Вестерн-блоттинга, соответственно. Было показано, что среди исследованных тканей зрелый белок сосредоточен в основном в мышцах и, немного, в сердце. Наибольший уровень мРНК был обнаружен в гемоцитах и сердце.