|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИПМех РАН |
||
Методы электронно-микроскопических исследований в зоологии беспозвоночныхучебный курс
- Автор: Бисерова Н.М.
- Год создания: 2009
- Организация: МГУ имени М.В. Ломоносова
- Описание: Преамбула. Курс представляет собой цикл лекций и практические занятия, в которых даны теория и практика электронно-микроскопических исследований для биологов. В лекциях даны общие сведения о принципах устройства и работы электронных микроскопов, их возможностях и перспективах использования. Рассмотрены теоретические основы методов подготовки водных животных для изучения ультраструктуры с применением трансмиссионного и сканирующего микроскопов. Даются основы знаний необходимых для приготовления фиксирующих растворов, современные методы фиксации, пропитывания и заключения в смолы определенных, заданных параметров. На практических занятиях слушатели знакомятся с устройством ультрамикротомов, получают практические навыки по изготовлению полутонких и ультратонких срезов, знакомятся с принципами контрастирования мембран для изучения в потоке электронов, и методами окраски срезов. В курсе даны основы знаний и практические навыки по исследованию ультраструктуры поверхности водных биологических объектов; особенности методов подготовки зоологического материала для исследования в сканирующем электронном микроскопе. Рассмотрены современные методы анализа изображений, появления артефактов, связанных с разными методическими погрешностями. Самостоятельный раздел курса посвящен устройству и принципу работы конфокального микроскопа. Подробно рассматриваются методы подготовки биологического материала для изучения под конфокальным микроскопом; методы визуализации наноструктур. Даются основы иммуноцитохимии для зоологов, навыки работы с антителами. Практическая часть включает занятия на конфокальном микроскопе и методы обработки полученных результатов, 3D реконструкция, сохранение данных в разных форматах. Даются основы техники безопасности при работе с фиксирующими жидкостями и электронно-микроскопической техникой. Студенты, завершившие изучение данной дисциплины должны: - знать теоретические основы электронной и конфокальной микроскопии; - познакомиться с различными типами электронных микроскопов; - иметь представление об устройстве электронных (просвечивающие, сканирующие), световых флуоресцентных и лазерных конфокальных микроскопов; - знать современные способы подготовки материала для различных методов микроскопии; - иметь практические навыки подготовки материала для различных методов микроскопии; - иметь практические навыки работы на основных типах микроскопов; - знать основы техники безопасности при работе в химической лаборатории с фиксирующими жидкостями и электронно-микроскопической техникой. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ Тема 1: Общие сведения об истории создания, принципах устройства и работы просвечивающих (трансмиссионных) электронных микроскопов (ТЭМ). Вакуумная система, электронные линзы, разрешение в ТЭМ. Астигматизм и особенности фокусировки. Новые возможности и перспективы использования в биологии. Тема 2: История создания и принцип работы сканирующего (растрового) электронного микроскопа (СЭМ). Разрешение и получение изображения. Астигматизм и особенности фокусировки в растровом микроскопе. Возможности и перспективы использования в биологии. Тема 3: Методы подготовки водных животных для изучения ультраструктуры с применением трансмиссионного электронного микроскопа. Особенности биологических объектов. Понятие фиксации живого объекта. Нормы международного кодекса работы с животными. Общие принципы предфиксационной подготовки животных. Тема 4: Основы техники безопасности при работе с фиксирующими жидкостями, растворителями, ЛВЖ, летучими и токсичными веществами; безопасность при работе с электронно-микроскопической техникой. Тема 5: Основы знаний для приготовления буферных смесей и фиксирующих растворов, современные методы фиксации. Фиксация: цель фиксации, размеры кусочков, способы взятия ткани для фиксации. Способы фиксации: перфузия, прижизненная, биопсия. Основные параметры фиксации: выбор фиксирующих растворов, температуры, времени, необходимость использования буферных смесей, физиологических значений pH и осмомолярности. Тема 6: Свойства фиксаторов. Образование поперечных связей между молекулами, возникновение прочной сети связей. Особенности воздействия фиксаторов на разные группы молекул. Альдегидные фиксаторы. Четырехокись осмия. Другие фиксаторы для электронной микроскопии. Тема 7: Маточные растворы и разведение. Понятие молярности раствора. Концентрация раствора. Понятие осмотического давления. Расчет осмомолярности раствора. Приготовление буферных смесей и фиксаторов заданной осмомолярности. Тема 8: Основные принципы подготовки фиксированных объектов для исследования в высоковакуумной системе трансмиссионного электронного микроскопа. Способы дегидратации, переходные жидкости. Эпоксидные смолы, основные свойства различных смол, цель использования, условия пропитывания ткани и полимеризации. Тема 9: Основы знаний для исследования ультраструктуры поверхности водных биологических объектов; особенности методов подготовки зоологического материала для исследования в сканирующем электронном микроскопе. Предфиксационная подготовка; методы очистки поверхности объекта; фиксация; дегидратация. Понятие раздела сред, давления поверхностного натяжения. Знакомство с методом высушивания в критической точке. Принцип работы установки, свойства переходных жидкостей. Тема 10: Формирование изображения в сканирующем электронном микроскопе. Понятие электропроводности объекта. Напыление (или покрытие) объекта разными электропроводящими металлами и углеродом. Тлеющий разряд. Преимущества ионного напыления в тлеющем разряде. Способы монтировки объектов для придания электропроводности. Тема 11: Принципы работы ультрамикротомов; условия, необходимые для корректной работы прибора. Тримминг, полезные свойства пирамиды. Найфмекер – прибор для изготовления стеклянных ножей; особенности стеклянной режущей поверхности. Принципы изготовления полутонких и ультратонких срезов. Методы монтировки срезов. Методы контрастирования мембран для изучения в потоке электронов. Химические свойства контрастёров, основы знаний для работы с радиактивными веществами и солями тяжелых металлов. Тема 12: Анализ изображений, полученных при работе на трансмиссионном или сканирующем электронном микроскопе. Понятие артефакта. Виды артефактов. Условия появления артефактов, связанных с разными методическими погрешностями. Тема 13: Устройство и принцип работы конфокального микроскопа. Методы подготовки зоологического материала для изучения под конфокальным микроскопом; методы визуализации наноструктур. Понятие флуоресценции. Основные свойства флуорофоров. Спектральный диапазон; спектр поглощения или возбуждения (Excitation), спектр испускания (Emission). Автофлуоресценция. Тема 14: Основы иммуноцитохимии для зоологов. Основные методы окраски антигенов. Прямые методы. Непрямые (сэндвич) методы. Теоретические основы подготовки биологического объекта для проведения иммуноцитохимической реакции. Способы фиксации, заморозки. Преинкубация: цели, задачи и методы этапа. Подготовка инкубационных растворов, разведение антител, способы хранения. Первичные и вторичные антитела: цели, задачи и методы этапа. Изготовление препаратов: среды для заключения, способы хранения. ПРАКТИКУМ Практическое занятие 1: Знакомство с лабораторным оборудованием, правила поведения и работы в лаборатории микротомии; организация графика дежурств, подготовка лабораторной посуды и необходимого инвентаря. Инструкция по технике безопасности. Практическое занятие 2: Приготовление натрий-натриевого фосфатного буфера с заданным значением pH. Знакомство с работой на электронных весах, pH-метре. Особенности подготовки посуды для хранения маточных растворов. Практическое занятие 3: Приготовление натрий-какодилатного буфера с заданным значением pH. Знакомство с мерами предосторожности и техникой безопасности при работе с фиксаторами. Приготовление фиксатора 2.5% глутарового альдегида. Самостоятельная фиксация объектов, 1 этап. Практическое занятие 4: Приготовление осмиевого фиксатора: подготовка посуды для фиксатора; приготовление маточного раствора четырехокиси осмия; приготовление фиксатора четырехокиси осмия необходимой концентрации. Фиксация объектов методом двойной глутар-осмиевой фиксации. Практическое занятие 5: Навыки работы с высокополимерными смолами. Расчет необходимого количества готовой смолы и расчет смешиваемых компонентов для приготовления эпоксидных смол (эпон, аралдит) заданных параметров. Дегидратация и начальный этап пропитки фиксированных объектов для ТЭМ. Практическое занятие 6: Самостоятельная работа с объектами. Подготовка материала для изучения на трансмиссионном электронном микроскопе (дегидратация объектов, поэтапная пропитка смолой, полимеризация). Практическое занятие 7: Подготовка материала для изучения на сканирующем электронном микроскопе (дегидратация, высушивание объектов в установке критической точки, самостоятельная монтировка объектов на столики, ионное напыление). Практическое занятие 8: Знакомство со сканирующим электронным микроскопом, самостоятельное изучение подготовленных на занятиях образцов, анализ изображения, анализ артефактов, правила хранения данных. Практическое занятие 9: Подготовка материала для изучения на трансмиссионном электронном микроскопе. Тримминг – подготовка блоков для резки, или как сделать пирамидку. Приготовление красителей для полутонких срезов, 1% раствор метиленовой сини для окраски эпоксидных срезов. Практическое занятие 10: Изготовление стеклянных ножей, анализ режущей поверхности. Обучение работе на ультрамикротомах УМТП3, LKBIII; изготовление полутонких срезов. Самостоятельная работа с объектами. Практическое занятие 11: Приготовление контрастёров для ультратонких срезов: 4% водного уранилацетата; 4% водного цитрата свинца. Приготовление раствора формвара и изготовление пленочных подложек для ультратонких срезов. Практическое занятие 12: Обучение и самостоятельное изготовление ультратонких срезов на ультрамикротоме. Монтировка срезов на сетки и бленды с подложками. Контрастирование срезов. Самостоятельная работа с объектами. Практическое занятие 13: Знакомство с просвечивающим электронным микроскопом, самостоятельное изучение подготовленных на занятиях срезов, анализ изображения, анализ артефактов, правила хранения негативов и файлов. Практическое занятие 14: Приготовление фиксатора для иммуноцитохимических исследований. Фиксация материала для работы на конфокальном микроскопе. Основные этапы подготовки ткани для проникновения антител, подготовка растворов для преинкубации. Преинкубация. Подготовка растворов первичных антител. Инкубирование объектов; основы знаний о первичных и вторичных антителах, навыки работы с флуорофрами. Коньюгирование с вторичными антителами. Заключение препарата в среду с заданными светопреломляющими параметрами. Практическое занятие 15: Знакомство с конфокальным микроскопом, просмотр препарата в режимах флуоресцентной лампы и при сканировании лазерами; захват изображения по оси x/y; xyz; xzy. Практическое занятие на конфокальном микроскопе. Методы обработки полученных результатов, 3D реконструкция, сохранение данных в разных форматах. РЕКОМЕНДОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА Гайер Г. Электронная гистохимия. Изд. “Мир”. Москва. 1974. 488 с. Луппа Х. Основы гистохимии. М.; “Мир”. 1980. 343 с. Ровенский Ю.А. Растровая электронная микроскопия нормальных и опухолевых клеток. Медицина. 1979. 151 с. Уикли Б. Электронная микроскопия для начинающих. Изд. «Мир”. 1975 324с. Bozzola J.J., Russell L.D. 1999. Electron Microscopy. 2nd Ed. Jones & Bartlett Pub. Inc. Sudbury. MA. 670p. Coons A.H., Leduc E.H., Connoly J.M. Studies on antibody production. I. A method for the histiochemical demonstration of the specific antibody and its application to a study of the hyper immune rabbit // J. of Experimental Medicine. 1955. 102. P. 49-60. Gustafsson M.K S. Skin the tapeworms before you stain their nervous system. A new method for whole-mount immunocitochemistry // Parasitol. Res. 1991. 77. P. 509-516. Maunsbach A.B., Afzelius B.A. 1999. Biomedical Electron Microscopy: illustrated methods and interpretation. Academic Press. USA. 548p. De la Torre J. G., Surgeon J.W. A methodological approach to rapid and sensitive monoamine histofluorescence using a modified glyoxylic acid technique: the SPG method // Histochem. 1975. Vol. 49. N2. P. 81-93. Saper C. B., Sawchenko P. E. 2003. Magic peptides, magic antibodies: guidelines for appropriate controls for immunohistochemistry. The Journal of Comparative Neurology. 465:161–163. Saper C. B. 2005. An open letter to our readers on the use of antibodies. The Journal of Comparative Neurology 493:477–478.
- Добавил в систему: Бисерова Наталья Михайловна
Преподавание курса
- 1 октября 2015 - 30 декабря 2015 Бисерова Наталья Михайловна
- МГУ имени М.В. Ломоносова, Биологический факультет, Кафедра зоологии беспозвоночных
- обязательная, базовой части, лекции
- Автор: Бисерова Н.М.
- с 1 сентября 2008 Бисерова Наталья Михайловна
- МГУ имени М.В. Ломоносова, Биологический факультет, Кафедра зоологии беспозвоночных
- обязательная, базовой части, практические занятия, 60 часов
- Автор: Бисерова Н.М.