Аннотация:Работа посвящена изучению изменения локализации каспаз-2, -3, -8, -9 при индукции повреждений ДНК. Исследования проводились на клеточных линиях аденокарциномы человека HeLa и Caov-4. В качестве индуктора генотоксического стресса использовался цисплатин (35 мкМ).
На первом этапе работы разработана методика, позволяющая получать ядерные фракции данных клеток, свободные от примесей других компартментов. Чистота цитозольной и ядерных фракций оценивалась фазово-контрастной и флуоресцентной микроскопией (окрашиванием Hoechst) и методом вестерн-блоттинга (анализируется локализации белков-маркеров цитоплазматической мембраны, цитоплазмы, митохондриальной фракции и эндоплазматического ретикулума; чистота цитозольной фракции подтверждается отсутствием в ней маркеров ядра).
Применение методики на втором этапе работы показало преимущественно цитоплазматическую локализацию каспаз-2, -3, -8, -9 в норме в обеих клеточных линиях и накопление их процессированных форм в ядерной фракции в ответ на обработку цисплатином. Измерение ядерной активности каспаз-2, -3 и -8 подтвердило результаты, полученные методом вестерн-блота. Транслокация каспазы-2 была также подтверждена оценкой изменения локализация каспазы-2-GFP методом конфокальной микроскопии. Для дополнительного подтверждения транслокации каспаз-2, -3, -8, -9 использовался метод иммунофлуоресцентного анализа в совокупности с конфокальной микроскопией.