|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИПМех РАН |
||
Присутствует ли 5S рРНК в составе митохондриальных рибосом клеток человека?дипломная работа (Специалист)
- Научный руководитель: Каменский П.А.
- Автор: И.В.Чичерин
- Тип: Специалист
- Организация, в которой проходила защита: МГУ имени М.В. Ломоносова
- Год защиты: 2012
- Аннотация: В течение многих лет точка зрения, согласно которой в составе митохондриальных рибосом млекопитающих отсутствует 5S рРНК, считалась канонической. Данное положение было основано на том, что геном митохондрий млекопитающих не кодирует 5S рРНК. Что еще более важно, на это указывали результаты криоэлектронной микроскопии очищенных митохондриальных рибосом. Однако в этой работе в составе органелл не обнаруживались также некоторые рибосомные белки, которые впоследствии были детектированы в них альтернативными методами (иммунопреципитацией). Более того, нашими французскими коллегами из Университета Страсбурга с участием нашей группы было показано, что 5S рРНК импортируется в митохондрии клеток человека из цитозоля, и что ее количество в митохондриальном матриксе строго соответствует количеству митохондриальных рибосом. В ходе этой работы было также обнаружено, что одним из белковых факторов импорта 5S рРНК в митохондрии является предшественник митохондриального рибосомного белка L18 (preMRPL18). Этот белок, как известно, взаимодействует с 5S рРНК в составе всех рибосом, содержащих данный РНК-компонент. На основании всего вышеизложенного мы предположили, что отсутствие 5S рРНК в митохондриальных рибосомах млекопитающих, показанное ранее, является следствием методических ошибок при выделении рибосом. Целью данной работы является проверка наличия или отсутствия 5S рРНК в митохондриальных рибосомах человека с помощью альтернативных и, по нашему мнению, более адекватных методов. Для выполнения данной цели мы собираемся клонировать ген preMRPL18, слитый с последовательностью, кодирующей так называемый FLAG-tag, в экспрессионный вектор серии pcDNA5. При трансфекции клеток человека полученной плазмидой вышеописанный ген должен встраиваться в активно транскрибируемую область генома. Далее мы планируем выделить митохондрии из клеток полученной линии человека, причем способы их обработки и последующего лизиса будут мягче, чем те, которые использовались ранее для проведения криоэлектронной микроскопии рибосом. После этого, используя метод иммунопреципитации с антителами к FLAG-tag, а также некоторые другие методы, мы собираемся очистить митохондриальные рибосомы и проверить наличие в них 5S рРНК при помощи Норзерн-блот гибридизации. Экспериментальные задачи работы: 1. Получить генно-инженерную конструкцию, кодирующую предшественник митохондриального рибосомного рибосомного белка L18 человека, слитый с последовательностью FLAG-tag, в векторе pcDNATM 5/FRT/TO. 2. Получить линию клеток человека, в которой вышеописанная конструкция встроилась в геном при помощи Flp-рекомбинации. 3. Выделить митохондриальные рибосомы из вышеописанной линии клеток с помощью иммунопреципитации антителами против FLAG-tag. 4. Оценить количество 5S рРНК в митохондриальных рибосомах клеток вышеописанной линии относительно количества 12S и 16S рРНК.
- Добавил в систему: Каменский Петр Андреевич