|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИПМех РАН |
||
Влияние замены метионина в 182 положении на стабильность бета-лактамазы ТЕМ типадипломная работа (Специалист)
- Научные руководители: Григоренко В.Г., Рубцова М.Ю.
- Автор: Алтухова А.В.
- Тип: Специалист
- Организация, в которой проходила защита: МГУ имени М.В. Ломоносова
- Год защиты: 2019
- Аннотация: Актуальность работы. В настоящее время эффективность применения бета-лактамных антибиотиков, наиболее широко применяемого класса антибиктериальных препаратов, ограничена распространением устойчивых к ним штаммов бактерий. Основным механизмом резистентности к бета-лактамам является продукция бактериальных ферментов – бета-лактамаз, которые гидролизуют амидную связь в бета-лактамном кольце антибиотика. Наличие широкого полиморфизма бета-лактамаз, по-видимому, играет существенную роль в адаптации и выживании бактерий в изменяющихся внешних условиях. Вследствие большого разнообразия этих ферментов и опасности их широкого распространения актуальным является комплексное изучение их каталитических свойств, структуры и стабильности. Цель и задачи работы. Дипломная работа Алтуховой А.В. посвящена изучению механизмов резистентности, обусловленных продукцией бета-лактамаз ТЕМ типа - наиболее часто мутирующих ферментов из всех описанных типов. Цель дипломной работы состояла в изучении каталитических свойств и термостабильности бета-лактамаз ТЕМ типа с заменами по 182 положению. Интерес к этому исследованию обусловлен многочисленными литературными данными о стабилизирующем влиянии замены М182Т, детальный молекулярный механизм которого не установлен, и полученными в лаборатории расчетными данными о возможном участии остатка аргинина 65 в осуществлении механизма стабилизации. Результаты дипломной работы: Созданы 11 штаммов E.coli - продуцентов рекомбинантных ферментов бета-лактамаз TEM типа с аминокислотными заменами по положению 182. Разработан метод выделения и очистки рекомбинантных ферментов. Определены каталитические параметры и изучена термоинактивация трех мутантных форм бета-лактамаз ТЕМ типа с заменами R65L, М182А и R65L+М182Т. Установлено, что единичная замена R65L не приводит к изменению спектра субстратной специфичности, однако, приводит к резкому снижению устойчивости фермента к термоинактивации и значительному падению уровня биосинтеза в клетке. Методом ДСК определены значения температуры денатурации и изменения энтальпии данных ферментов. Экспериментально подтверждено влияние остатка аргинина 65 на стабильность фермента, предсказанное расчетами молекулярной динамики, предложено объяснение возможного механизма этого процесса. Проведен полный мутагенез бета-лактамазы ТЕМ-1 по положению 182 и изучена термоинактивация отдельных мутантов (с заменами метионина на Аla, Cys, Asp, Phe, Gly, His, Asn, Gln, Тhr, Val, Trp, Tyr). Показано разнонаправленное влияние некоторых мутаций, в частности, установлено, что замена М182С приводит к дестабилизации, а замены М182(А/Т) - к увеличению стабильности фермента. Показано, что фермент с заменой М182А является сравнимым по термостабильности с ферментом с заменой M182T - самой термостабильной из описанных бета-лактамаз. Предложено объяснение разнонаправленного влияния мутаций.
- Добавил в систему: Григоренко Виталий Георгиевич