Аннотация:В настоящее время очень остро стоит проблема устойчивости микроорганизмов к известным антибактериальным средствам. При воздействии какого-либо антибиотика в геноме бактерий может происходить ряд мутаций, приводящих к появлению нового механизма резистентности к неблагоприятному фактору. Эти изменения закрепляются в ходе естественного отбора и способствуют выживанию бактерий в условиях воздействия антибиотика. Одним из примеров является наличие у многих бактерий бета-лактамаз, расщепляющих бета-лактамное кольцо в молекулах пенициллинов. Новые механизмы защиты бактерий сильно осложняют лечение инфекций. Основными путями решения этой задачи являются комбинированная терапия, а также усовершенствование существующих антибактериальных молекул и создание новых.
Одной из альтернатив антибиотикам и синтетическим антибактериальным средствам являются бактериофаги. Уже много лет они используются для борьбы с инфекциями, вызванными различными возбудителями. Однако есть и минусы применения таких лекарственных препаратов. Бактериофаги сложно и долго выделять из бактериальных культур, они могут переносить гены бактериальных токсинов, к ним зачастую может возникать устойчивость бактерий, а также их фармакокинетические характеристики трудно определить и нормировать.
Новым классом антибактериальных агентов, которому не присущи вышеуказанные минусы, являются лизины. Это активные ферменты, которые выделяются бактериофагами и используются ими для лизиса пептидогликана клеточных стенок. Эти белки способны быстро и специфично уничтожать различные штаммы микроорганизмов. Очень важным аспектом является невозможность развития к ним резистентности за счет того, что мутировавшие бактерии не являются жизнеспособными. Лизины обладают огромным потенциалом в борьбе с различными патогенами, являясь отличной альтернативой антибиотикам. В настоящее время проводится множество исследований по их применению в различных областях: от медицины до нанотехнологий.
Учитывая тот факт, что бактериофаги являются наиболее распространенными на Земле организмами, фаговые лизины очень разнообразны структурно и функционально, что открывает большое число возможностей для их использования.
Одним из опаснейших возбудителей нозокомиальных инфекций является синегнойная палочка, борьба с которой сильно затруднена в связи с ее устойчивостью к антибиотикам, а также способностью образовывать биопленки. Данный вид бактерий является грамотрицательным и имеет наружную мембрану, наличие которой мешает действию лизинов снаружи клеток, поэтому необходим дополнительный механизм для проникновения лизина через нее. Для того чтобы справиться с этой проблемой, был создан новый класс лизинов – артилизины. Это соединения, представляющие собой ковалентно сшитые эндолизин и пептид, который позволяет перенести молекулу через наружную мембрану грамотрицательных бактерий. Перспективным пептидом для этих целей является белок SMAP-29 (миелоидный антимикробный пептид овцы), обладающий способностью нарушать целостность наружной мембраны. Его укороченная версия - рекомбинантный пептид [K2,7,13]-SMAP-29(1–17) обладает оптимальными антимикробными свойствами, не представляющими опасность для организма человека.
Таким образом, целью данной дипломной работы является получение и характеристика антисинегнойного рекомбинантного артилизина, созданного на основе эндолизина фага КРР10 и фрагмента миелоидного антимикробного пептида SMAP-29.
Для достижения цели работы поставлен ряд задач:
- получить генно-инженерную конструкцию для экспрессии рекомбинантного артилизина (AL-KPP10), выделить и очистить AL-KPP10 для дальнейших исследований;
- изучить антибактериальную активность AL-KPP10 на различных штаммах синегнойной палочки.