|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИПМех РАН |
||
Выделение и исследование методом спектроскопии ЯМР белковых компонент теломеразного комплекса дрожжей Saccharomyces cerevisiaeдипломная работа (Специалист)
- Научные руководители: Польшаков В.И., Шаранов Ю.С.
- Автор: Манцызов А.Б.
- Тип: Специалист
- Организация, в которой проходила защита: МГУ имени М.В. Ломоносова
- Год защиты: 2006
- Аннотация: На концах хромосомных ДНК эукариот находятся нуклеопротеиновые комплексы – теломеры. Они выполняют ряд важных функций в клетке: участвуют в формировании структуры ядра и регуляции репликации прилежащих генов, препятствуют слиянию концов ДНК и их узнаванию как двухцепочечного разрыва системами репарации клетки, защищают ДНК от деградации эндонуклеазами. Однако наиболее интересной функцией теломер является защита смысловой последовательности ДНК от деградации в результате неполной репликации цепи ДНК. В итоге многочисленных клеточных делений теломерная ДНК деградирует, клетка стареет; начинается потеря значимой части ДНК, что приводит к апаптозу. В некоторых клетках, для которых природой предусмотрен неограниченный потенциал деления, таких как, например, половые и раковые клетки, существует механизм поддержания постоянной длины теломер, позволяющий избежать подобной ситуации. Наиболее распространенный путь – обратнотранскрипционное удлинение теломер с помощью теломеразы – фермента, являющегося сложным рибонуклеопротеином. Установлено, что теломеразы всех исследованных организмов содержат РНКЮ а также включают белковую субъединицу, являющуюся обратной транскриптазой. Структура и функции большинства теломеразных субъединиц различных организмов остается мало изученными. В то же время, именно повышенная активность теломеразы делает раковые клетки бессмертными. Предпринимаются попытки борьбы с раковыми заболеваниями путем воздействия на теломеразу. Детальное понимание механизма действия фермента и структура этого сложного рибонуклеопротеинового комплекса является необходимым шагом в борьбе с раковыми заболеваниями. Дрожжи S.cerevisiae являются удобным модельным объектом для изучения теломеразы, вследствие чего фермент этого организма был выбран в качестве объекта исследования в данной дипломной работе. С помощью программы гомологического моделирования Robetta Full Chain Structure Prediction построены модели структуры белков теломеразного комплекса дрожжей Saccharomyces cerevisiae Est2p и Est3p. Проведена оценка качества предсказания, анализ структур и сравнение их со структурами известных гомологов. Показано высокое структурное соответствие 10-ти полученных моделей фрагмента ладони каталитического домена Est2p 571-745 а.о., а также его сходство с аналогичным фрагментом белка p66 вируса HIV-1. Подобраны условия для экспрессии рекомбинантного белка F-домена Est2p в клетках E.coli BL21 (DE3) с конструкциями F-Est2p-pET30 Ek/LIC. Показано, что в клеточном лизате белок находится в растворимой форме. Установлено, что выделенный белок обладает невысокой стабильностью в растворе. Для повышения его стабильности предсказаны места мутагенеза. Исследованы условия очистки рекомбинантного белка Est3p-GST методом ионообменной хроматографии. Исследована ГТФ-азная активность белка Est3p методом ЯМР на ядрах 31P. Показано, что ГТФ-азная активность белка существенно замедляется в присутствии рибо и дезоксириибонуклеотидов с последовательностью, имитирующей G-богатую цепь теломер Saccharomyces cerevisiae, а добавление ДНК/РНК полностью элиминирует активность, что свидетельствует о важной регуляторной функции белка Est3p в работе теломеразного комплекса.
- Добавил в систему: Польшаков Владимир Иванович