Аннотация:Проведен биоинформатический анализ структурной организации ферментов
семейства пенициллин G ацилаз и ихгомологов. Показано, что гомологи
пенициллинацилаз широко представлены в суперсемействе Ntn-гидролаз ферментами,
которые катализируют реакцию гидролиза амидной связи по сходному механизму, однако
принципиально отличаются по субстратной специфичности. Создана база данных
ферментов семейства Ntn-гидролаз, которая объединяет геномную и структурную
информацию о гомологичных семействах пенициллин G ацилаз, цефалоспоринацилаз,
ацилгомосеринлактон гидролаз, пенициллин V ацилаз, гидролаз желчных кислот, ацетил-
КоА:изопенициллин N ацилтрансферраз, аспартат-продуцирующих ферментов и изомераз
(ацилтрансферраз). Получены данные о распределении типов аминокислотных остатков
по подсемействам ферментов с различными свойствами. Созданная база данных делает
возможным систематическое изучение структурно-функциональных взаимосвязей в
суперсемействе Ntn-гидролаз, а также может быть использована для создания
фокусированных библиотек для белковой инженерии.
Были выявлены два структурно-обособленных кластера аминокислот, которые
могут определять различия в субстратной специфичности ферментов: остатки области
связывания ацильной группы субстрата и остатки, участвующие во взаимодействиях с
нуклеофильным ядром и уходящей группой. Методом молекулярного докинга природных
субстратов пенициллинацилазы и её гомологов
в структуры нативной и измененной
пенициллин G ацилазы из E.coli было показано, что замена специфических остатков на
соответствующие остатки из гомологичных ферментов приводит к уменьшению сродства
фермента к его природному субстрату, но увеличивает аффинность к субстратам
соответствующих гомологов. Так, показано улучшенное связывание глутарил-7-
аминоцефалоспорановой кислоты при внесении тройной замены F24βL/V56βN/L177βA;
цефалоспорина С при замене F146αK/P49βM/I177βG; пенициллина V при замене
F24βL/L177βY.
Молекулярное моделирование точечных замен остатков, лежащих в
области связывания нуклеофильной части субстратов с помощью молекулярной динамики
фермент-субстратных комплексов выявило влияние остатков Arg145α и Phe146α на
подвижность нуклеофильной части субстрата и, как следствие, ориентацию амидной связи
субстрата относительно каталитического остатка.
Описана группа специфических остатков, участвующих в процессе катализа.
Показано, что эти остатки могут оказывать влияние непосредственно на процесс
каталитического превращения путем активации каталитического нуклеофила (Arg263β,
Glu23β, Trp240β) или участвуя в стабилизации интермедиата (Thr68β, Asn178β).