|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИПМех РАН |
||
Разработка и оптимизация методов бесклеточной продукции мембранных белковдипломная работа (Магистр)
- Научный руководитель: Люкманова Е.Н.
- Автор: Капицкая Кристина Юрьевна
- Тип: Магистр
- Организация, в которой проходила защита: МФТИ
- Год защиты: 2011
- Аннотация: Интегральные мембранные белки (МБ) играют ключевую роль в возникновении и развитии различных заболеваний человека и в настоящее время являются самыми распространенными мишенями действия лекарств. Однако низкий уровень рекомбинантной экспрессии и сложность получения этих белков в нативной конформации до сих пор сильно затрудняют структурно-функциональные исследования МБ [1]. Существуют два способа рекомбинантной продукции МБ: продукция в клетках и с использованием бесклеточных систем синтеза. В первом случае встраивание синтезированных рекомбинантных белков в мембрану клетки-хозяна может негативно влиять на жизнеспособность и целостность клеток. Избыток чужеродных МБ может быть токсичным для клетки, поэтому их редко удается получить в препаративных количествах. Рекомбинантные МБ при синтезе в прокариотической системе in vivo часто синтезируются в виде нерастворимых телец включения, что значительно усложняет процедуру получения белка в функционально активной форме в достаточных для дальнейших исследований количествах. Как следствие, на данный момент определены только около 80 структур различных МБ, в то время как известны структуры нескольких тысяч растворимых белков [2]. В последнее время для продукции мембранных белков все большую популярность приобретают сопряженные бесклеточные системы синтеза (БСС) транскрипции-трансляции [ссылка]. На сегодняшний день выходы целевых белков в этих системах достигают нескольких миллиграммов с миллилитра трансляционной смеси (ТС), что дает возможность получать белковые препараты в количествах, необходимых для биологических, биохимических и биофизических исследований. Бесклеточные системы имеют несколько преимуществ перед системами, основанными на клеточной продукции. Во-первых, в такой системе синтезируется только целевой продукт, во-вторых, эти системы открыты для внесения каких-либо веществ, взаимодействующих с белком, например, кофакторов, ингибиторов, лигандов, а также агентов, позволяющих удерживать синтезируемый полипептид в нативной конформации. Для продукции МБ в трансляционную смесь добавляют мембраномоделирующие компоненты, поддерживающие МБ в растворимой форме, такие как мицеллы детергентов, липосомы, или липопротеиновые частицы (липид-белковые нанодиски, ЛБН). Кроме того, БСС позволяют легко получать белковые препараты, селективно меченные стабильными изотопами, что в ряде случаев облегчает проведение структурных исследований белков методами спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Таким образом, разработка методов эффективной бесклеточной продукции МБ является актуальной задачей молекулярной биологии и открывает широкие перспективы для структурно-функциональных исследований и практического применения этих белков.
- Добавил в систему: Люкманова Екатерина Назымовна