Аннотация:Интегральные мембранные белки (МБ) участвуют во многих процессах, необходимых для жизни отдельных клеток и многоклеточных организмов. Эти белки ответственны за клеточную энергетику, межклеточное узнавание, а также за процессы проведения сигналов и транспортировки различных веществ через клеточную мембрану [1]. Согласно современным данным, МБ составляют более 25% всех белковых последовательностей, закодированных в геноме высших животных, включая человека [2]. Одними из наиболее фармакологически важных классов МБ являются рецепторы, сопряженные с G-белками (GPCR). Именно мембранные рецепторы этого класса являются мишенями для ~ 30% современных лекарственных препаратов [3].
Мускариновые ацетилхолиновые рецепторы (мАХР) человека М1 - М5 типов относятся к семейству GPCR [4] и представляют собой трансмембранные рецепторы, принимающие участие в регуляции поведения калиевых каналов и в подавлении медленных, потенциал-независимых кальциевых токов. Объект данной работы, рецептор типа М1 человека, в основном локализован в ЦНС, и с его дисфункцией связаны некоторые неврологические заболевания. Было установлено, что когнитивное расстройство, наблюдающееся при болезни Альцгеймера, связано с потерей холинергической функции, и что центральную роль в этом процессе играет мАХР М1 типа (М1-мАХР) [5]. Предполагается, что высокоселективный агонист данного рецептора может способствовать восстановлению кортикальной холинергической функции, что может остановить развитие болезни. Данные недавних исследований [6] позволяют предположить, что недостаточный синтез некоторых типов мАХР связан с развитием некоторых форм шизофрении, и направленное воздействие, в особенности, на рецепторы М1 типа может привести к улучшению состояния больных. Таким образом, исследование механизмов активации и взаимодействия с лигандами М1-мАХР представляет интерес не только с фундаментальной, но и с практической точки зрения. Однако, несмотря на огромную важность для новых разработок в области фармакологии и медицины, М1-мАХР остается мало изученным, и его пространственная структура и механизмы, лежащие в основе его регуляции, до сих пор не установлены.
В настоящее время структурно-функциональные исследования GPCR значительно затруднены [7]. Сложившаяся ситуация во многом связана с невозможностью выделения достаточных количеств белковых препаратов из природных источников, а также с трудностями, возникающими при создании высокоэффективных систем гетерологической продукции этих МБ [8]. В течение последнего десятилетия совместное использование систем экспрессии, основанных на эукариотических клетках, и новых методов рентгеноструктурного анализа позволило определить пространственные структуры для ряда рецепторов семейства GPCR [7], включая β2-адренорецептор (β2AR) [9] и мАХР человека M2 и M3 типов [10, 11]. Эти работы позволили значительно продвинуться в понимании принципов пространственной организации GPCR, однако для детального исследования функциональной динамики и механизмов работы мембранных рецепторов требуется применение спектроскопических методов высокого разрешения, таких как гетероядерная ЯМР-спектроскопия [12].
Методы структурной биологии требуют получения очищенного и высококонцентрированного белка в нативной конформации. Однако, уровень экспрессии GPCR в нативных клетках недостаточен [7], и возникает необходимость разработки системы экспрессии и методов очистки, позволяющих получить белки семейства GPCR в виде, пригодном для структурных исследований.
В последнее время для продукции мембранных белков все большую популярность [13] приобретают системы бесклеточного синтеза белка. Среди преимуществ таких систем можно отметить следующие: достаточно высокий выход (миллиграммовые количества белка с миллилитра трансляционной смеси), возможность добавления в трансляционную смесь различных компонентов, способствующих синтезу белка в нативной конформации и значительную простоту получения препаратов, селективно меченных стабильными изотопами, что в ряде случаев облегчает проведение структурных исследований белков методами ЯМР-спектроскопии.
Данная работа посвящена разработке бесклеточной системы продукции мускаринового ацетилхолинового рецептора человека М1 типа, разработке методов ренатурации полученного белкового препарата и исследованию его функциональной активности.