|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИПМех РАН |
||
Разработка специализированных систем доставки терапевтических мРНК в клетки млекопитающихдипломная работа (Магистр)
- Научный руководитель: Дмитриев С.Е.
- Автор: Федоровский А.Г.
- Тип: Магистр
- Организация, в которой проходила защита: МГУ имени М.В. Ломоносова
- Год защиты: 2023
- Аннотация: В настоящее время во всем мире бурно развивается новый терапевтический подход, основанный на использовании матричных РНК (мРНК-терапия). Препараты на основе мРНК уже применяются в клинике в качестве вакцин против широкого спектра инфекционных заболеваний, как противоопухолевые лекарства, а также для лечения генетических заболеваний человека. Одним из центральных компонентов любого препарата для мРНК-терапии является его система доставки, которая позволяет направить синтезированную in vitro мРНК в клетки живого организма. Наиболее изученным и часто используемым методом для этого является доставка с помощью смеси катионных и вспомогательных липидов. При данном способе липиды и мРНК формулируются в липосомные наночастицы (англ. lipid nanoparticles, LNP), способные проникать в клетки и высвобождать заключенную в них мРНК в цитоплазму с последующим синтезом целевого белка на рибосомах. Эффективность трансфекции (доставки нуклеиновых кислот, в частности мРНК, в эукариотические клетки) в первую очередь определяется химическим составом липида, используемого для формирования липидных наночастиц. В качестве модели для изучения эффективности трансфекции можно использовать иммортализованные клеточные линии млекопитающих. В исследовательской практике для мРНК-трансфекции клеточных линий часто применяют т.н. “фьюжн-липиды”, механизм работы которых основывается на слиянии липидных наночастиц с мембраной клетки, приводящем к немедленному высвобождению мРНК в цитоплазму. Применение липидов такого рода в живых организмах нецелесообразно из-за высокой скорости их взаимодействия с клетками, которая приводит к полному поглощению их непосредственно в месте введения и исключает доставку в другие части организма. Для преодоления обозначенной проблемы необходимо изменить химический состав липидов, чтобы обеспечить проникновение мРНК в клетки с помощью эндоцитоза. Целью данной работы было испытание новых катионных липидов для доставки мРНК, нахождение оптимальных параметров трансфекции и определение её эффективности. Оценить эффективность трансфекции можно по двум параметрам: общему уровню экспрессии доставляемой нуклеиновой кислоты и проценту трансфицированных клеток. Для оценки первого параметра удобно использовать люциферазную систему, в которой мРНК, кодирующая люциферазу светлячка, доставляется с использованием исследуемого липида в клеточную культуру, после чего измеряется временная интенсивность люминесценции. Второй параметр можно измерить, используя мРНК, кодирующую зеленый флуоресцентный белок (eGFP), и определяя процент флуоресцирующих клеток путём их подсчета на проточном цитофлуориметре. В ходе работы в опытах по трансфекции культивируемых клеток млекопитающих матричной РНК проведена оценка эффективности новых катионных липидов 2X3, 2X7 и 2S3, разработанных в группе проф. М.А.Маслова (МИТХТ), с точки зрения количества наработанного продукта и процента трансфицированных клеток в зависимости от времени после трансфекции. Найдены оптимальные параметры получения липидных наночастиц для мРНК-трансфекции изучаемыми липидами (отношение N/P, соотношение липид:DOPE, среда для замешивания смесей) на трёх клеточных линиях и обнаружена существенная задержка выхода продукта трансляции трансфицированных мРНК (от 1.5 до 10 ч), которая свидетельствует об эндоцитоз-опосредованном механизме доставки мРНК изучаемыми липидами. Разработан оригинальный удобный протокол для количественной оценки доли трансфицированных клеток методом проточной цитофлуориметрии в зависимости от времени.
- Добавил в систему: Дмитриев Сергей Евгеньевич