|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИПМех РАН |
||
Исследование роли гена Gagr , геномного гомолога гена gag ретровирусов, в стрессовом ответе у Drosophila melanogasterдипломная работа (Магистр)
- Научные руководители: Ким Александр Иннокентьевич, Нефедова Лидия Николаевна
- Автор: Балакирева Евгения Игоревна
- Тип: Магистр
- Организация, в которой проходила защита: МГУ имени М.В. Ломоносова
- Год защиты: 2017
- Аннотация: Благодаря появлению высокопроизводительного секвенирования, универсальных методов генной инженерии и молекулярной биологии, последние десятилетия ознаменованы стремительным развитием генетики, и, в этой связи, Drosophila melanogaster служит мощным модельным объектом для изучения практически всех фундаментальных генетических процессов. В основе универсальности дрозофилы как модельного организма лежит схожесть клеточных и молекулярных механизмов, то есть их консервативность, у дрозофилы и млекопитающих, что повышает практическую значимость фундаментальных исследований на дрозофиле для медицинской генетики и других областей генетики. Так, например, сигнальные пути Notch, Hedgehog (Hg) и Wingless (Wnt), задействованные в эмбриогенезе дрозофилы, а также сигнальные пути Runt и Hippo, участвующие в гематопоэзе и росте тканей у дрозофилы, обнаружены и у человека (Wang et al., 2014). Нарушение функционирования сигнальных путей приводит к развитию различных раковых заболеваний. Поскольку формирование опухолей сопряжено также с нарушениями иммунного ответа, не меньший интерес представляет изучение функционирования иммунных сигнальных путей NFκB, JNK, и JAK-STAT у дрозофилы, которые консервативны с таковыми у позвоночных (Bangi et al., 2013). Наравне с известными иммунными механизмами и путями, в защитных реакциях у позвоночных весомую роль играют мобильные элементы, что было показано благодаря развитию биоинформатических методов сравнения последовательностей геномов. В последнее время найдены примеры того, как мобильные элементы изменяют регуляторные генные сети, участвующие в иммунных реакциях у млекопитающих (Chuong et al., 2016). Кроме модифицирования регуляторных сетей, мобильные элементы могут становится источником новых генов и таким образом приводить к формированию новых иммунных механизмов вследствие процесса доместикации (Chuong et al., 2016; Naville et al., 2016). Большое количество доместицированных генов млекопитающих и других позвоночных происходят от генов эндогенных ретровирусов и ДКП-ретротранспозонов. Ретровирусы имеют схожее строение с ДКП-ретротранспозонами с двумя (gag, pol) или с тремя открытыми рамками считывания (gag, pol, env) и отличаются способностью к инфицированию, то есть перемещению не только внутри генома одной клетки, но и между клетками, что определяется наличием функционального гена env (envelope). Продуктом первой рамки, gag, является структурный белок Gag, формирующий капсид и связывающий с ним РНК-геном вируса. Данная открытая рамка считывания перекрывается со второй, pol, необходимой вирусу для перемещения и кодирующей такие ферменты, как протеаза, ревертаза, РНКаза Н и интеграза. Последовательности всех трех рамок считывания могут подвергаться доместикации и приводить к образованию новых семейства генов, объединенных общим полезным функциональным значением для организма-хозяина в разнообразных процессах, в том числе иммунном ответе. Так, предполагается, что у позвоночных в противовирусном ответе могут принимать участие гомолог первой рамки считывания gag ген Fv1, гомолог гена вирусной интегразы ген CGIN1 и ген Fv4, гомологичный третей рамке считывания env (Naville et al., 2016). Доместицированные ретровирусные гены, участвующие в защитных процессах, могут регулироваться консервативными у млекопитающих и дрозофилы иммунными путями (Naville et al., 2016). В связи с этим, особый интерес представляет изучение роли доместикации ретровирусных генов для иммунитета позвоночных на примере более простой модельной системы, такой как дрозофила. В геноме D. melanogaster были обнаружены всего два примера доместикации gag и env генов ретровируса-ретротранспозона gypsy - Gagr (Gag related protein) и Iris соответственно (Nefedova et al., 2014, Malik, Henikoff, 2005). Предполагается, что функция гена Iris у дрозофилы связана с защитой от вирусов (Malik, Henikoff, 2005). Не исключено, что Gagr также может участвовать в защитных иммунных реакциях. В пользу этого предположения свидетельствуют исследования, в которых было показано, что экспрессия Gagr возрастает в ответ на присутствие активного ретровируса gypsy (Nefedova et al., 2014), и других РНК-содержащих (DCV, SINV) и ДНК-содержащих (FHV) вирусов (Kemp et al., 2013). Паразитическая бактерия Listeria monocytogenes и липополисахариды клеточной стенки грамотрицательных бактерий также могут приводить к активации Gagr (Goto et al., 2010, Silverman et al., 2003). Работы, в которых показано физическое взаимодействие белкового продукта гена Gagr с белками Adam, Pdi, 14-3-3epsilon, участвующих в ЭПР-стрессе (стрессовом ответе в эндоплазматическом ретикулуме), также указывают на то, что ген Gagr может играть важную роль в стрессовом ответе, при окислительном стрессе, действии патогенов и других воздействий, приводящих к ЭПР-стрессу у дрозофилы (Guruharsha et al.,2012; Landis et al., 2012). Исследование функции и регуляции гена Gagr является важным и пионерским шагом в изучении участия доместицированных ретровирусных генов в иммунных и стрессовых механизмах. Цель работы: исследование роли гена Gagr, геномного гомолога гена gag ретровирусов, в стрессовом ответе у D.melanogaster. Для достижения цели были поставлены следующие задачи: 1. Исследование влияния окислительного стресса (вызываемого воздействием параквата и персульфата аммония) на экспрессию гена Gagr на уровне транскрипции у имаго Drosophila melanogaster. 2. Исследование влияния окислительного стресса на экспрессию гена Gagr на уровне транскрипции в зависимости от времени воздействия персульфата аммония у имаго D.melanogaster. 3. Исследование тканевой специфичности активации экспрессии гена Gagr на уровне транскрипции в ответ на персульфат аммония у имаго D.melanogaster. 4. Исследование экспрессии гена Gagr на уровне транскрипции в ответ на персульфат аммония на различных стадиях развития D.melanogaster. 5. Анализ экспрессии изоформ транскрипта гена Gagr при окислительном стрессе у имаго D. melanogaster. 6. Нокдаун гена Gagr и исследование его влияния на экспрессию генов стрессового ответа Rel, vir-1, Upd3 у имаго D.melanogaster. ВЫВОДЫ 1. Показано, что транскрипция гена Gagr активируется при окислительном стрессе, вызванным паракватом и персульфатом аммония, у имаго D.melanogaster, что указывает на возможное участие белкового продукта гена Gagr в клеточных процессах, связанных с окислительным стрессом у дрозофилы. 2. Выявлено, что воздействие персульфатом аммония вызывает активацию транскрипции Gagr более чем через 20 часов, что значительно позже эффекторных генов окислительного стресса - vir-1, upd3, Rel, hid, что, возможно, указывает на специфическую роль гена Gagr на позднем этапе окислительного стресса. 3. Установлено, что ген Gagr специфически активируется в тканях каркаса при окислительном стрессе, что указывает на его стресс-индуцируемую регуляцию в жировом теле. 4. Обнаружено, что ген Gagr специфически активируется при окислительном стрессе на стадии имаго, но не на стадиях куколки и личинки третьего возраста. 5. Выявлено, что изоформы транскрипта гена Gagr (Gagr-A и Gagr-B) имеют различную регуляцию: транскрипт Gagr-A имеет более высокий уровень и подвержен стресс-индуцируемой регуляции, транскрипт Gagr-B обнаруживается в незначительном количестве и не индуцируется в условиях окислительного стресса. 6. По-видимому, функция гена Gagr влияет на процессы, связаннные с активацией экспрессии STAT-индуцируемых изоформ гена vir-1 и не влияет на процессы, связанные с активацией экспрессии мишеней JNK-каскада — upd3, Rel.
- Добавил в систему: Ким Александр Иннокентьевич