|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИПМех РАН |
||
Влияние мутации Q39Kв бета-лактамазе TEM типа в сочетании с ключевыми мутациями на каталитические свойства ферментадипломная работа (Специалист)
- Научный руководитель: Григоренко В.Г.
- Автор: Иштубаев И.В.
- Тип: Специалист
- Организация, в которой проходила защита: МГУ имени М.В. Ломоносова
- Год защиты: 2017
- Аннотация: В настоящее время эффективность применения β-лактамных препаратов, составляющих более 50% мирового рынка антибиотиков, для лечения широкого круга тяжелых инфекционных заболеваний ограничена распространением устойчивых к ним штаммов микроорганизмов. Основным механизмом резистентности микроорганизмов к β-лактамным антибиотикам является продукция бактериальных ферментов β-лактамаз, которые разрушают β-лактамное кольцо антибиотика. Наличие широкого полиморфизма у суперсемейства β-лактамаз, по-видимому, играет существенную роль в адаптации и выживании микроорганизмов в изменяющихся внешних условиях. Вследствие большого разнообразия β-лактамаз и опасности их широкого распространения актуальным является комплексное изучение свойств и структуры β-лактамаз. Дипломная работа Иштубаева И.В. посвящена изучению механизмов резистентности, обусловленных продукцией β-лактамаз ТЕМ типа, которые относятся к наиболее распространенному молекулярному классу А и являются наиболее часто мутируемыми из всех описанных типов. У белков данного типа имеются так называемые «ключевых» мутации, которые приводят к расширению спектра субстратной специфичности (фенотип 2be) и устойчивости к ингибиторам (клавулановая кислота и др.) (фенотип 2br). Был проведен анализ не ключевых, так называемых «сопутствующих» мутаций, роль которых не установлена. Показано, что подавляющая часть «сопутствующих» мутаций затрагивает аминокислотные остатки, расположенные на значительном удалении от активного центра фермента, часть из них является поверхностными. Более подробно был проанализирован остаток глутамина 39, который является наиболее часто мутируемым. Целью данной работы является изучение роли замены остатка глутамина в 39 положении на лизин (Q39K) в комбинации с ключевыми мутациями на свойства соответствующих форм β-лактамаз ТЕМ типа. В задачи работы входила разработка систем экспрессии отдельных генов β-лактамаз ТЕМ типа в клетках E.coli, отличающихся одиночными аминокислотными заменами: Q39K, M69V, E104K, R164S, M182T; выделение и очистка активных форм рекомбинантных ферментов с последующим определением каталитических параметров. В результате выполнения дипломной работы были созданы 9 штаммов E.coli - продуцентов рекомбинантных ферментов β-лактамаз молекулярного класса А TEM типа, отличающихся аминокислотными заменами: Q39K, M69V, E104K, R164S, M182T, Q39K+M69V, Q39K+E104K, Q39K+R164S, Q39K+R164S+E104K. Разработан метод выделения и очистки рекомбинантных ферментов. Впервые определены каталитические параметры рекомбинантных форм β-лактамаз ТЕМ типа по субстрату CENTA. Показано, что наличие замены Q39K в сочетании с ключевыми мутациями, относящимися к БЛРС фенотипу (Q39K+E104K; Q39K+R164S; Q39K+R164S+E104K) и ингибитор-устойчивым (Q39K+M69V) приводит к снижению значений констант Михаэлиса. Показано что нейтральная единичная замена Q39K в комбинации с ключевыми мутациями в положениях 69, 104 и 164 оказывает дестабилизирующее воздействие на фермент в экспериментах по термоинактивации. Впервые показано стабилизирующее влияние замены R164S на способность фермента к термореактивации. Предложено объяснение разнонаправленного влияния Q39K и R164S, которое может быть связано с увеличением или уменьшением энергии cis–trans перехода связи Glu-166‒Pro-167, что в свою очередь приводит к разному соотношению изомеров и как следствие активной и неактивной конформаций фермента. Создан информационный ресурс в сети интернет, объединяющий имеющиеся в настоящий момент данные рентгеноструктурного анализа (RCSB, PDB) с соответствующими имеющимися данными по аминокислотным последовательностям β-лактамаз.
- Добавил в систему: Григоренко Виталий Георгиевич