|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИПМех РАН |
||
Получение и характеристика мутантной оксидазы D-аминокислот из дрожжей Trigonopsis variabilis с многоточечными аминокислотнымидипломная работа (Специалист)
- Научные руководители: Тишков В.И., Голубев И.В.
- Автор: Зарубина София Александровна
- Тип: Специалист
- Организация, в которой проходила защита: МГУ имени М.В. Ломоносова
- Год защиты: 2014
- Аннотация: Оксидаза D-аминокислот (DAAO) – FAD-зависимая оксидоредуктаза, которая стереоспецифично окисляет D-аминокислоты с образованием α-кетокислоты, иона аммония и пероксида водорода. Данный фермент играет важную физиологическую роль и активном внедряется в практику. Самое крупнотоннажное производство с участием DAAO – это двухстадийная конверсия природного антибиотика цефалоспорина С (CephC) в 7-аминоцефалоспорановую кислоту (7-АЦК). Из этого соединения производится более половины всех полусинтетических антибиотиков цефалоспоринового ряда. Среди известных природных оксидаз самую высокую активность с CephC имеет DAAO из дрожжей Trigonopsis variabilis (TvDAAO). В течение последних лет было получено большое количество мутантных TvDAAO. Среди этих мутантов в случае окисления CephC успешными оказались как замены в положениях 54 и 108 (расположенные в субстрат-связывающем домене), а также в положениях 32 и 33 (расположенные в районе аденин-связывающего участка кофактор-связывающего домена активного центра). Целью настоящей работы являлось получение и характеристика мутантных форм оксидазы D-аминокислот из дрожжей Trigonopsis variabilis, в которых объединены положительные аминокислотные замены в каталитическом и кофермент-связывающих доменах. В результате данной дипломной работы были получены один тройной и три четверных мутанта оксидазы D-аминокислот из дрожжей Trigonopsis variabilis (TvDAAO): Glu32Arg/Phe33Asp/Cys108Phe, Glu32Arg/Phe33Asp/Phe54Ala/Cys108Phe, Glu32Arg/Phe33Asp/Phe54Ser/Cys108Phe и Glu32Arg/Phe33Asp/Phe54Tyr/Cys108Phe. Мутантные TvDAAO были экспрессированы в клетках E.coli и выделены в высокоочищенном состоянии. Было показано, что профили каталитической эффективности у многоточечных мутантных ферментов напоминают соответствующие профили своих предшественников с заменами в 54 и 108 положениях. Четверные мутанты проявляют немного более высокие каталитические свойства, чем тройной мутант. Установлено, что все полученные ферменты стабильнее TvDAAO дикого типа и своих точечных предшественников. Тройной мутант TvDAAO Glu32Arg/Phe33Asp/Cys108Phe проявил наибольшую стабильность. Показано, что в ряде случаев после объединения мутаций на первой или второй стадии инактивации наблюдается аддитивность стабилизирующего эффекта.
- Добавил в систему: Тишков Владимир Иванович