|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИПМех РАН |
||
Продукция биспецифического антитела, узнающего HER2/neu, в растении Nicotiana benthamianaкурсовая работа (Специалист)
- Научный руководитель: Комарова Т.В.
- Автор: Калашникова А.И.
- Тип: Специалист
- Организация, в которой проходила защита: МГУ имени М.В. Ломоносова
- Кафедра: Факультет биоинженерии и биоинформатики
- Год защиты: 2017
- Курс: 2
- Аннотация: Развитие биотехнологии в последние десятилетия позволило рассматривать растение как «фабрику» для получения рекомбинантных белков. Благодаря высокому уровню синтеза в растительной клетки и относительной простоте очистки антитела являются наиболее перспективным объектом для продукции в растении. В настоящее время существует более 40 терапевтических моноклональных антител (ТМА), подавляющее большинство из которых используется для лечения различных типов рака у человека, в том числе HER2/neu-позитивного рака молочной железы. HER2/neu принадлежит к семейству рецепторов эпидермального фактора роста человека. Повышенный уровень HER2/neu, вызванный, как правило, суперэкспрессией кодирующего его гена ErbB2, выявляется в ~25-30% случаев рака молочной железы. Ранее в нашей лаборатории были получены два антитела против HER2/neu: растительный биосимиляр трастузумаба (РБТ) и пертузумаба (РБП), взаимодействующие с IV и II доменами HER2/neu, соответственно. Целью данной работы было создание биспецифического антитела против онкобелка HER2/neu. Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи: 1) создание генетических конструкций, кодирующих легкую и тяжелую цепи биспецифического антитела, узнающего два различных эпитопа HER2/neu; 2) оценка уровня накопления антитела в растении Nicotiana benthamiana, трансформированного полученными генетическими конструкциями. Используя подход, направленный на создание биспецифического антитела, обладающего свойствами иммуноглобулина G, мы сконструировали «мозаичное» антитело, содержащее вариабельные фрагменты как РБТ, так и РБП. При этом к легкой и тяжелой цепи РБП с N-конца был добавлен вариабельный домен соответствующей цепи РБТ через 9 а.к. линкер [3]. Для получения генетических конструкций, кодирующих легкую и тяжелую цепь биспецифического антитела, был применена технология «бесшовного» клонирования с использованием рестриктазы BsaI, вносящей разрыв в цепь ДНК за пределами сайта узнавания. Целевые гены находились под контролем 35S-промотора вируса мозаики цветной капусты в составе бинарных векторов на основе pCambia1300. Доставку генетических конструкций в клетки листьев N. benthamiana осуществляли с помощью Agrobacterium tumefaciens. На 3 день после заражения проводили оценку уровня накопления биспецифического антитела в растительном экстракте, разделяя растворимые белки в полиакриламидном геле с последующей детекцией тяжелой и легкой цепей антитела при помощи вестерн-блота. Мы показали, что в инфильтрированных листьях накапливаются легкая и тяжелая цепи, которые затем «собираются» в полноразмерное биспецифическое антитело.
- Добавил в систему: Комарова Татьяна Валерьевна