|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИПМех РАН |
||
Влияние замен остатка цистеина в 298-м положении на термостабильность мутантных оксидаз D аминокислот из дрожжей Trigonopsis variabilisкурсовая работа (Специалист)
- Научные руководители: Атрошенко Д.Л., Тишков В.И.
- Автор: Карнаухов В.К.
- Тип: Специалист
- Организация, в которой проходила защита: МГУ имени М.В. Ломоносова
- Кафедра: Кафедра физической химии
- Год защиты: 2017
- Курс: 4
- Аннотация: Оксидаза D-аминокислот (DAAO) – фермент, катализирующий окисление D аминокислот в соответствующие α-кетокислоты. Абсолютная стереоспецифичность фермента и его активность со многими природными и неприродными аминокислотами открывают широкие возможности для его использования в биотехнологии. С использованием DAAO разработаны процессы получения самых различных α-кетокислот и оптически чистых неприродных L аминокислот, используемых в тонком органическом синтезе и в фармацевтике. Наиболее крупномаштабным и значимым биотехнологическим процессом с использованием DAAO является получение из цефалоспорина C 7 аминоцефалоспорановой кислоты, синтона для синтеза цефалоспориновых антибиотиков. В настоящее время в этом процессе используется DAAO из дрожжей Trigonopsis variabilis (TvDAAO), которая обладает наилучшей температурной стабильностью и активностью с цефалоспорином С. Однако операционная стабильность фермента, определяющаяся в первую очередь устойчивостью к нагреву и модификации химическими соединениями, является недостаточной, чтобы биотехнологический процесс мог по рентабельности конкурировать с гораздо менее экологичным химическим производством 7 аминоцефалоспорановой кислоты. Поэтому важной задачей является инженерия свойств природного фермента с целью повышения его температурной стабильности и устойчивости к пероксиду водорода, выделяющемуся в процессе катализируемой ферментом реакции. Для этого в нашей лаборатории проводят эксперименты по получению мутантных TvDAAO с помощью метода рационального дизайна. Для выбора положений для мутагенеза, замены в которых могут привести к улучшению свойств фермента, необходимо знание ключевых стадий механизма температурной инактивации фермента. Вторым субстратом фермента является кислород, который возвращает кофермент FAD в окисленную форму, при этом восстанавливаясь до пероксида водорода. В клетках эукариот TvDAAO локализована в пероксисомах, где H2O2 разлагается каталазами и не наносит клетке вреда. Однако при использовании фермента в биотехнологических процессах образование пероксида водорода в качестве побочного продукта представляет серьезную проблему, поскольку H2O2 ускоряет инактивацию TvDAAO. Одним из путей решения этой проблемы является создание мутантных форм фермента с улучшенной химической стабильностью при помощи метода рационального дизайна. Предполагается, что инактивация фермента под действием пероксида водорода связана с окислением остатков цистеина и метионина. Ранее в нашей лаборатории было исследовано влияние замен ряда остатков метионина. Однако ни один из мутантов не продемонстрировал улучшения окислительной стабильности. Для дальнейших исследований был выбран остаток цистеина в 298-м положении (C298), который располагается в канале, по которому кислород диффундирует в активный центр фермента. С помощью компьютерного моделирования были определены 4 аминокислоты (глицин, изолейцин, глутамин и аспарагин), замены на которые потенциально способны привести к улучшению термпературной и окислительной стабильности фермента. Целью данной работы являлось получение 4 мутантных форм TvDAAO с заменами остатка цистеина в 298-м положении, изучение механизма и определение кинетических и активационных параметров их термоинактивации.
- Добавил в систему: Атрошенко Денис Леонидович