|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИПМех РАН |
||
МОРФОЛОГИЯ И ЭНЕРГИЗАЦИЯ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО АППАРАТА КЛЕТОК КУМУЛЮСА, КАК ПОКАЗАТЕЛЬ КАЧЕСТВА ООЦИТОВ И ЭМБРИОНОВкурсовая работа (Бакалавр)
- Научный руководитель: Высоких М.Ю.
- Автор: Машкин М.А.,
- Тип: Бакалавр
- Организация, в которой проходила защита: МГУ имени М.В. Ломоносова
- Кафедра: Кафедра эмбриологии
- Год защиты: 2017
- Курс: 4
- Аннотация: Введение По оценкам Всемирной Организации Здравохранения не менее 12% пар репродуктивного возраста сталкиваются с проблемой бесплодия (Bulletin of the World Health Organization, 2010). Для решения этой проблемы в настоящее время создан ряд вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), не редко включающих процедуру экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Одним из этапов ЭКО является гормональная стимуляция пациентки для достижения множественной овуляции. Большое количество ооцитов, полученных таким образом, позволяет увеличить шанс успеха процедуры, за счет возможности выбора наилучших ооцитов и затем пересадки наиболее перспективных эмбрионов. Однако при использовании различных протоколов стимуляции невозможно гарантировать получение только зрелых ооцитов. Особо острым моментом реализации любых ВРТ является выбор качественного ооцита и эмбриона с наиболее перспективными имплантационными качествами. Определение такого эмбриона или ооцита – один из ключевых моментов при использовании вспомогательных репродуктивных технологий (Jeve et al., 2015). К сожалению, на данный момент не существует универсальной системы оценки качества эмбрионального материала, а общепринятые методики, используемые в медицинской практике, не дают абсолютно предсказуемого результата. В связи с этим распространенной тактикой проведения процедуры ЭКО является перенос не менее двух эмбрионов, что в свою очередь может привести к возникновению многоплодной беременности и, как следствие, различным осложнениям. Часто методом оценки качества эмбрионального материала является не только изучение морфологии дробления, но и инвазивные процедуры связанные с биопсией одного или нескольких бластомеров для исключения генетических аномалий. Существуют вполне закономерные риски связанные с такими манипуляциями (D. Brodie et al, 2014). Необходимо также отметить, что существующие методы оценки морфологии ооцитов, основаны на визуальном осмотре эмбриолога, и результаты такого метода могут сильно отличатся в зависимости от квалификации, опыта и тд. Нахождение новых маркеров, свободных от влияния человеческого фактора, является целью многих исследований. В настоящий момент стоит вопрос нахождения и разработки методики позволяющей оценить качество эмбриона и ооцитарного материала косвенным, не инвазивным способом. 3 Одним из перспективных направлений исследований является изучение клеток кумулюсного окружения ооцита. Целью работы является морфологический анализ митохондрий и создание на его основе модели оценки функционального состояния ооцитов, полученных методом гормональной стимуляции овуляции, и эмбрионов на различных стадиях культивации. В соответствии с указанными целями, задачами данной работы являются: 1) Создание методики анализа и оценки митохондриального аппарата клеток кумулюса. 2) Разработка автоматизированного метода определения значений морфологических параметров митохондрий. 3) Обнаружение корреляций между функциональным состоянием и морфологией митохондрий клеток кумулюса и состоянием ооцитов/эмбрионов. Методы: Объекты исследования В соответствии с целью и задачами работы объектом исследования были выбраны клетки кумулюсного окружения ооцита, полученные от пациенток, обратившихся для проведения лечения бесплодия по программе ЭКО/ИКСИ в ФГБУ "НЦАГиП им. В.И. Кулакова". Исследование было одобрено комиссией по этике биомедицинских исследований. Перед вступление в программу ЭКО проходили процедуру измерения роста и массы тела. Затем производился расчет индекса массы тела (ИМТ) по формуле Кетле. По результатам значения ИМТ, согласно рекомендациям Всемирной Организации Здравоохранения (WHO guideline), пациентки были распределены в одну из трех групп: I группа - женщины с нормальной массой тела, ИМТ=18,5-24,99. II группа - женщины с избыточной массой тела, ИМТ= 25,0- 29,99. III группа - женщины с ожирением, ИМТ> 30,0. Также проводили определение характера распределения жировой ткани. Для этого определяли объем талии и окружность бедер, и рассчитывали значение показателя ОТ/ОБ. Культивирование, оценка функционального состояния и морфологии ооцита и эмбрионов Незамедлительно после отбора фолликулярной жидкости производилось обнаружение ооцитарно-кумулюсных комплексов (ООК) и оценка их зрелости под стереомикроскопом на нагретой поверхности стерильного ламинарного бокса. Во время всех манипуляций поддерживалась температура 370С. Ооциты отмывали от фолликулярной жидкости и крови и помещали в стерильные планшеты Nunc с культуральной средой ДМЕМ/F12 (ПанЭко, Россия) на 2-3 часа с целью предварительной инкубации при температуре 370 С в атмосфере с 5% СО2. Затем проводили их оценку согласно следующему методу: 1) Зрелым ооцитам на стадии метафазы 2 мейоза (М2) было присвоено 3 балла. 9 2) Ооцитам находящимся на стадии метафазы 1 мейоза (М1), а также М2 - ооцитам с существенными отклонениями (грануляция цитоплазмы, наличие в ней рефрактерных телец и расширенное перивителлиновое пространство) присвоили 2 балла. 3) Ооцитам находящимся на стадии профазы 1, а также М1 - ооцитам со значительными отклонениями был присвоен 1 балл. 4) Дегенерировшим ооцитам было присвоено 0 баллов. Метод оплодотворения ЭКО или ИКСИ определялся в соответствии с медицинскими показаниями. После оплодотворения ооциты переносили в культуральную среду с целью дальнейшего культивирования и оценки. Оценку морфологии дробления и развития эмбрионов проводили на 1, 3 и 5 сутки после оплодотворения в соответсвии с классификацией, установленной международным согласительным совещанием ESHRE в 2009 г Забор клеток кумулюса производили механическим путем, после чего клетки помещались в пронумерованные чашки с буферной средой для гамет, термостатированной до 370С. Клетки кумулюса культивировали на чашках Петри, адаптированных для микроскопии в среде для культивирования ДМЕМ/F12 с добавлением пенициллина/стрептомицина и 10% сыворотки, в условиях СО2-инкубатора (+37, 5% СО2, влажность 95%). На пятый день культивирования живые адгезированные на поверхность чашки клетки окрашивали флуоресцентными красителями согласно инструкции фирмы производителя: MitoTracker Green (Life Technologies, США) – краситель зеленого цвета, окрашивающий митохондрии, независимо от величины потенциала на их мембране; Тетраметилродамин (TMRM) (Life Technologies, США) – краситель красного цвета, специфически окрашивающий метаболически-активные митохондрии; Hoechst (Life Technologies, США) – краситель синего цвет, специфически связывающийся с ДНК и использующийся для окрашивания клеточных ядер. Снимки окрашенных клеток делали на флуоресцентном микроскопе Zeiss (Германия) при увеличение х63 (масляная иммерсия), по 8-10 полей зрения на каждую чашку Петри. Для анализа изображений применялась программа ImageJ (National Institute of Health, США) и использовался специально написанный Java-скрипт Для статистической обработки данных использовали программу "PowerGraph Prism" (PowerGraph, США). Данные анализировали с использованием двух подходов: а) в предположении, что независимым элементом выборки является ооцит и б) что независимым элементом выборки является пациент. В каждом из этих двух случаев проводили корреляционный анализ с использованием непараметрического коэффициента Спирмена и с использованием двухфакторного дисперсионного анализа (факторы «энергизация» и «качество ооцита/эмбриона») с последующим попарным сравнением групп с использованием критерия Тьюки. Результаты: Деятельность митохондриального аппарата клеток кумулюса имеет важное значение для успешного созревания ооцита. Морфология митохондрий, а особенно, их площадь и периметр может указывать на функциональное состояние всего кумулюсного окружения. Введенные в данной работе параметры могут дополнительно охарактеризовывать степень развития митохондрий (Таблица 3). Таблица 3. Значение параметра митохондрии характеризует её форму. В целом можно утверждать, что степень развития митохондриального аппарата в клетках кумулюса положительно связана с качеством ооцита и состоянием эмбриона на 5 сутки после оплоотворения (Таблица 2). Согласно данным этой работы значения площади и периметра, находящихся в клетках кумулюса, митохондрий, можно предположить, что чем выше это значение тем лучше ооцит. Такое предположение хорошо сходится с результатами исследований указывающими на прямую связь между степенью развития митохондриального аппарата клетки и её функционального состояния.( Motta P.M 2000;) Значение параметра округлости и эллиптичности в "хороших" ооцитах стримится к 0, что говорит о преобладании в клетках кумулюса митохондрий вытянутой формы. В то время как в "плохих" ооцитах это значение близко к 1. Показатель соотношения сторон демонстрирует сходную динамику. У положительно оцениваемых ооцитов в кумулюсных клетках преобладали вытянутые митохондрии, значение параметра в таких клетках стремится к большим величинам чем в клетках кумулюса от ооцитов худшего качества. 34 Также было показано, что параметр цельности митохондрий отрицательно связан с качеством ооцитов. Так в кумулусе полученном от ооцитов хорошего качества преобладают митохондрии более сложной формы. Обобщая полученные результаты можно сделать вывод, что митохондрии клеток кумулюса от хорошего ооцита, в целом, имеет более вытянутую форму и сильнее разветвлены по сравнению с митохондриями кумулюсных клеток плохих ооцитов. По видимому образующие разветвленную сеть митохондрии успешнее выполняют свои функции чем множество округлых и мелких. Данное предположение подтверждается рядом исследований указывающих на свойственную митохондриям форму разветвленного ретикулума. А преобладание разобщенных одиночных митохондрий может указывать на функциональные нарушения в клетках.( Jonathan R. Friedman & Jodi Nunnari, 2014) Обнаруженная достоверная связь между площадью и периметром митохондрий и ИМТ указывающая на то, что у женщин страдающих ожирение в среднем количество митохондрий в клетках кумулюса меньше. По-видимому это может приводить к функциональным нарушениям при росте и созревании фолликула и уменьшать шанс успешной беременности (Gorshinova V. et al.) Отсутствие достоверных корреляций между различными параметрами морфологии и ИМТ, а также отношением ОТ/БТ может быть обусловлено недостаточной выборкой пациенток. Необходимо отметить, что, созданная в рамках этой работы, модель обсчета параметров объектов на микрофотографиях, показала свою применимость для анализа митохондрий. Так как полученные результаты хорошо соотносятся с представлениями различных групп исследователей о функциональном строении митохондрий в клетках. Выводы: 1) Морфология митохондриального аппарата клеток кумулюса может служить дополнительным маркером при определении качества ооцитарного материала, и указывать на перспективность эмбриона. 2) Созданная модель анализа микрофотографий может применятся для оценки морфологических параметров митохондрий в клетках.
- Добавил в систему: Высоких Михаил Юрьевич