|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИПМех РАН |
||
Характеристика фермент-субстратного взаимодействия в глутарил ацилазе из Brevundimonas diminuta методами молекулярного моделированиякурсовая работа (Специалист)
- Научные руководители: Суплатов Д.А., Швядас В.К.
- Автор: Тахавеев Вакиль Ахматович
- Тип: Специалист
- Организация, в которой проходила защита: МГУ имени М.В. Ломоносова
- Кафедра: Факультет биоинженерии и биоинформатики
- Год защиты: 2013
- Курс: 3
- Аннотация: Полусинтетические цефалоспорины представляют наиболее распространенный в мире класс антибиотиков. Цефалоспорин С (CephC) – природная форма цефалоспорина, которая продуцируется грибами Cephalosporium acremonium в качестве вторичного метаболита. Большая доля производных цефалоспорина, имеющих клиническое применение, производится из 7-аминоцефалоспорановой кислоты (7-ACA). В свою очередь, 7-ACA может быть получена в рамках химического производства через деацилирование CephC в присутствии токсичных компонентов. Существенным препятствием к использованию экологически чистого ферментативного процесса для получения 7-ACA является чрезвычайно низкая специфичность глутарил ацилаз по отношению к CephC, в то время как природным субстратом этого фермента является структурно близкая к CephC глутарил-7-АСА, В связи с этим изучение молекулярных механизмов субстратной специфичности глутарил ацилаз представляет интерес как с фундаментальной, так и с практической точки зрения. На первом этапе в базе данных белковых последовательностей UniProt были определены все ферменты из суперсемейства Ntn-гидролаз, гомологичные глутарил ацилазе из Brevundimonas diminuta, что составило 1074 гомолога. Было построено соответствующее выравнивание аминокислотных последовательностей и проведен биоинформатический анализ, выявивший специфические позиции подсемейств (СПП) – те позиции, которые потенциально могут быть ответственны за субстратную специфичность. На втором этапе был использован ряд методов молекулярного моделирования для определения роли остатков из СПП в связывании и каталитическом превращении субстратов. Было выявлено, что ацильная группа глутарил-7-АСА – природного субстрата изучаемого фермента – связывается в сайте, составленном исключительно из остатков специфических позиций, что подчеркивает их значимость в субстратной дискриминации. В то же время β-лактамное кольцо – ядро цефалоспориновых антибиотиков – располагается в участке активного центра, построенном аминокислотными остатками из консервативных позиций. Это согласуется с тем фактом, что многие Ntn-гидролазы взаимодействуют с β-лактамными производными. Специфические позиции в сайте связывания ацильной группы субстрата были использованы как «горячие точки» для введения специфичности к CephC через in silico мутагенез. Была построена соответствующая библиотека 5645 вариантов глутарил ацилазы, содержащих от одной до четырех замен. Молекулярный докинг и скрининг были применены для исследования связывания CephC и глутарил-7-АСА в активных центрах ферментов из сконструированной библиотеки. Были использованы геометрические фильтры для выявления продуктивных фермент-субстратных комплексов. В результате, были определены варианты глутарил ацилазы с заменами Y→E, F→L, F→V, обладающие существенно большой аффинностью к CephC, чем нативный фермент. Данные замены предоставляют более выгодные электростатические взаимодействия и большее пространство для свяывания D-α-аминоадипиновой группы CephC. Таким образом, биоинформатический анализ и молекулярное моделирование были использованы для изучения механизма субстратной специфичности глутарил ацилазы и определения набора аминокислотных остатков, ответственных за субстратную дискриминацию в активном центре фермента. Варианты глутарил ацилазы из Brevundimonas diminuta с улучшенной специфичностью по отношению к CephC были направлены для экспериментального изучения.
- Добавил в систему: Суплатов Дмитрий Андреевич