ИСТИНА

Актуальность темы исследования Мобильные генетические элементы (МГЭ) – обязательная составляющая генома всех эукариотических организмов. Перемещения МГЭ вызывают повышенный уровень инсерционного мутагенеза, что приводит к геномной нестабильности, которую можно рассматривать как движущий фактор эволюционного процесса. С другой стороны, геномная нестабильность часто приводит к негативным последствиям для организма. Именно поэтому возникли механизмы, ограничивающие транспозиционную активность МГЭ. Так, например, уже достаточно давно у Drosophila. melanogaster известен локус flamenco, контролирующий транспозиции МГЭ gypsy [Prud'homme et al., 1995]. В последнее время этому локусу уделяется повышенное внимание [Zanni et al., 2013; Goriaux et al., 2014b]. Удалось установить, что локус flamenco состоит из дефектных копий МГЭ и является источником коротких антисмысловых РНК особого класса – piРНК, которые участвуют в сайленсенге МГЭ [Brennecke et al., 2007]. Таким образом, flamenco осуществляет контроль транспозиции по механизму РНК-интерференции. В настоящее время интенсивно исследуются механизмы функционирования piРНК-системы [Czech et al., 2013; Muerdter et al., 2013]. По-видимому, роль данного класса коротких РНК у разных организмов может быть значительно шире и не ограничиваться контролем МГЭ [Landry et al, 2013; Ross et al., 2014]. Известны линии D. melanogaster, мутантные по локусу flamenco. В нашей лаборатории такими линиями являются MS и SS, изогенные по происхождению [Kim et al., 1994a]. Несмотря на то, что эти две линии были описаны уже достаточно давно, молекулярные причины наблюдаемого мутантного фенотипа не известны вплоть до настоящего времени. Мы предпожили, что мутантный фенотип может быть обусловлен нарушениями не только в локусе flamenco, но и в других генах. В работе обсуждается возможная роль гена piwi в формировании мутантного фенотипа flamenco в линиях MS и SS. В геноме дрозофилы, кроме уже упомянутого gypsy, обнаружены родственные ему ретротранспозоны, которые объединены в одноименную систематическую группу [Nefedova, Kim, 2009]. Данные ретротранспозоны сходны по структуре с ретровирусами, а для gypsy инфекционные свойства были показаны экспериментально [Kim et al., 1994b]. Поэтому изучение механизмов ограничения активности таких элементов генома является актуальным. Хорошей модельной системой для изучения вышеуказанных процессов могут являться линии MS и SS. На данный момент актуальны два вопроса: 1) Приводит ли мутантный фенотип в линиях MS и SS к нарушению регуляции других МГЭ или является специфичным только для gypsy? Иными словами, пригодны или нет эти линии для изучения контроля родственных gypsy элементов? 2) Какова молекулярная природа нарушений в этих линиях, и связаны ли нарушения с функционированием системы piРНК? Ответить на эти 4 вопросы позволит анализ экспрессии ретротранспозонов группы gypsy в линиях MS и SS. Цель данной работы – анализ транскрипции ретротранспозонов группы gypsy для исследования причин генетической нестабильности в линиях Drosophila melanogaster, мутантных по локусу flamenco. Были поставлены следующие задачи: 1. Проанализировать экспрессию на уровне транскрипции ретротранспозонов группы gypsy в линиях MS и SS, мутантных по локусу flamenco. 2. Провести анализ экспрессии ретротранспозона Tirant в линии MS, различных отводках линии SS и у гибридов, полученных от скрещивания отводок 7Kw1 и 7K(1) между собой. 3. Методом вычитающей гибридизации определить, способны ли перемещаться копии элемента Tirant, присутствующие в геноме изучаемых линий. 4. Провести структурный анализ 5'-нетранслируемой области Tirant. 5. Осуществить скрещивания линий MS и SS с линией piwi3, гетерозиготной по мутации в гене piwi. Проанализировать уровень экспрессии gypsy в яичниках и семенниках гибридов и исходных родительских линий методом ПЦР в реальном времени. Проанализировать уровень экспрессии элемента Idefix в семенниках гибридов и исходных родительских линий. Научная новизна и практическая значимость работы Впервые было показано, что ретротранспозоны rover, 17,6, 297, Idefix, Quasimodo, Transpac, Tirant, gypsy, springer, opus, принадлежащие одной систематической группе – gypsy, экспрессируются на уровне РНК в линиях MS и SS, следовательно, данные линии пригодны для дальнейших исследований механизмов контроля вышеуказанных МГЭ. Впервые показано, что транскрипция ретротранспозонов rover, 17,6, 297, Idefix, Quasimodo, Transpac, Tirant, gypsy, springer, opus контролируется локусом flamenco. Для МГЭ Tirant впервые показан гетерогенный характер транскрипции в изогенных отводках линии SS. Впервые в изогенных отводках линии SS обнаружены структурные различия нетранслируемой области Tirant. Впервые обнаружена способность Tirant к транспозиции в линиях MS и SS. Впервые показано, что генетические дефекты в линиях D. melanogaster MS и SS не связаны с нарушением функции белка Piwi, однако связь с функционированием piРНК системы интерференции имеется. Впервые предложен новый способ детекции фенотипа flamenco, основанный на анализе экспрессии gypsy в семенниках. В дальнейших исследованиях линий MS и SS можно успешно применять вышеуказанный способ. Впервые в результате анализа литературных данных выявлены новые гены-кандидаты, мутации в которых потенциально могут обуславливать мутантный фенотип в SS и MS. Апробация работы Работа прошла апробацию на конференции «Спорт: медицина, генетика, физиология, биохимия, педагогика, психология» (Уфа, 2011), на 5 Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2012» (Москва), семинарах лаборатории генетики животных и заседаниях кафедры генетики биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова. Личное участие автора Работа выполнена лично автором. Выводы сделаны на основании собственных оригинальных данных. Структура и объем работы Диссертационная работа изложена на 116 страницах, содержит 27 рисунков, 5 таблиц и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 128 цитируемых источника. Публикации По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих Перечню ВАК – 3, тезисов докладов и материалов конференций – 3.