ИСТИНА

1. Изучена роль водородных связей в стабильности димера TvDAAO. Показано, что остатки Arg169 и Arg220 играют важную роль в поддержании димерной структуры фермента. Разрушение водородных связей, образованных этими остатками, приводит к получению активного, но нерастворимого фермента, и при этом происходит резкое снижение термостабильности. 2. Проведена оптимизация структуры кофактор-связывающего домена. Выполнена замена неоптимальных остатков в 33 и 32 положении. Получены двойные мутантные TvDAAO, которые обладают как улучшенными каталитическими свойствами, так и повышенной температурной стабильностью. 3. Проведены эксперименты по стабилизации TvDAAO с помощью универсального подхода гидрофобизации α-спиралей. Получено 8 мутантных форм фермента. Показано, что замена Ser105Ala приводит к повышению стабильности фермента. 4. Изучена роль остатков Phe54 и Phe258, расположенных на входе в активный центр. Показана исключительно важная роль этих остатков как в проявлении каталитических свойств, так и в термостабильности TvDAAO. Их замена на другие остатки позволяет резко сузить спектр субстратной специфичности. Кроме того, введение замен в 54 и 258 положении позволяет получить фермент с повышенной температурной стабильностью. 5. Показано, что остаток Phe в 54 положении играет важнейшую роль в реакции окисления цефалоспорина С. С помощью направленного мутагенеза были получены мутантные формы TvDAAO, обладающие существенно более высокими каталитической константой и каталитической эффективностью. Объединение замен в 54 и 108 положении привело к дальнейшему улучшению каталитических свойств TvDAAO в ходе окисления цефалоспорина С. 6. Изучена кинетика термоинактивации для всех полученных мутантных форм TvDAAO. За исключением одного фермента, термоинактивация мутантных TvDAAO протекает по двухстадийному диссоциативному механизму.